桂附地黃丸的體內(nèi)代謝化學(xué)成分研究

桂附地黃丸的體內(nèi)代謝化學(xué)成分研究

桂附地黃丸由地黃、山藥、山茱萸（制備）、澤瀉、牡荊、椰子葉、桂枝、附子等藥物組成。本證為腎陽虛證。根據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)的研究，該藥物具有降血糖、降血脂、增強免疫功能、改善內(nèi)政、消除自由基、改善腎功能、利尿、降血糖等作用。治療范圍包括神經(jīng)、內(nèi)政部、免疫、循環(huán)、尿常規(guī)、尿常規(guī)、，充分體現(xiàn)了中醫(yī)復(fù)方系統(tǒng)、多目標(biāo)、多軌跡的功能方法和治療特點[1.5]?？诜兴幖皬?fù)方后,通過胃腸道中消化液、消化酶及腸內(nèi)菌群的作用,中藥成分可能產(chǎn)生了變化,此時在胃腸道中存在著中藥成分的原型及其代謝產(chǎn)物,這些成分中一部分被吸收進(jìn)入血液,另一部分直接被排泄。進(jìn)入血液的成分可直接作用于第一靶點,使其分泌生理活性物質(zhì)進(jìn)入血液發(fā)揮藥效作用,或者經(jīng)門靜脈進(jìn)入肝臟,在肝臟藥酶的作用下代謝后,再進(jìn)入血液循環(huán),經(jīng)血液輸送到作用部位,以上成分構(gòu)成了血液中實際含有的有效成分群—藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。中藥及復(fù)方的體內(nèi)代謝化學(xué)的研究方法,是按照中藥有效成分的形成、吸收及分布規(guī)律,從給藥后的吸收入血的體內(nèi)成分分析入手來確定其藥效物質(zhì)基礎(chǔ),具有體內(nèi)篩選快速、命中率高等特點,不僅能真實反映中藥及復(fù)方從提取制備到體內(nèi)代謝過程中發(fā)生的化學(xué)變化,而且還重視了與中醫(yī)藥理論的聯(lián)系。目前,對桂附地黃丸體內(nèi)入血及代謝成分的研究尚未報道,本實驗采用液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對口服桂附地黃丸后大鼠血中的化學(xué)成分進(jìn)行分析,以闡明藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。1儀器及實驗設(shè)備Agilent1100液相色譜系統(tǒng)(配備四元梯度泵、真空脫氣機、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器);VL型離子阱液質(zhì)譜聯(lián)用儀(配備大氣壓電噴霧源ESI);儀器操作及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)采用HPLC-3D化學(xué)工作站。Milli-Q超純水制備機。TDL80-2B離心機(南通聯(lián)豐計量技術(shù)有限公司);XW-80A型快速蝸旋器(上海越磁電子科技有限公司);H66MC型超聲震蕩儀(上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司)。10~1000μL移液槍(Socorex公司出品)。1.2對照品的制備馬錢苷(批號:111640-200502)、芍藥苷(批號:110736-200520)、丹皮酚(批號:110708-200505)、肉桂酸(批號:110736-200508)對照品均來自中國藥品生物制品檢定所;乙腈(色譜純,山東禹王)、甲醇(色譜純,山東禹王)、甲酸(色譜純,上?？其J)、自制超純凈水、高氯酸(天津市東方化工廠)。1.3實驗動物Wistar大鼠,體質(zhì)量150~180g,雄性,哈醫(yī)大一院實驗動物中心提供,批號:黑動字第p00102008。2實驗方法2.1體外hplc分析按2010年版《中國藥典》中桂附地黃丸的處方量稱取藥材并按制法制成大蜜丸,稱取上述自制樣品各5g,用5倍量甲醇回流提取60min(溫度控制在75℃左右),濾過,濾液干燥后加入甲醇溶解,定容至10mL,溶液過0.45μm微孔濾膜,供體外HPLC分析用。另精密稱取馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚、肉桂酸各1.0mg,置于10mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,0.45μm微孔濾膜過濾,即得混合對照品溶液,供HPLC分析用。2.2胃藥的制備取自制桂附地黃丸,用5倍量甲醇于75℃回流提取60min,過濾,減壓回收,加水制成相當(dāng)于3g生藥/mL的混懸液。2.3灌胃水合氯醛麻醉后肝門靜脈內(nèi)固定術(shù)取Wistar雄性大鼠10只,每組5只,共2組,即空白組、全方組,連續(xù)喂養(yǎng)并給藥4周,于第4周周末禁食12h(自由飲水),按照2mL/100g體質(zhì)量,分別灌胃給予蒸餾水、桂附地黃丸的灌胃藥液,給藥60min后,用10%水合氯醛麻醉并經(jīng)肝門靜脈取血5mL,血液3000rpm條件下離心10min,取上清液1mL,加入0.6mL6%高氯酸,快速搖勻,3000rpm條件下離心10min,取上清液過0.45μm微孔濾膜,備以HPLC分析。2.4質(zhì)量分析和質(zhì)量分析的條件2.4.1u3000添加0.2.4%流動相色譜柱:WatersSymmetryShieldTMRP18(4.6mm×150mm,5μm);Nova-PakC18Guard-PakTM保護(hù)柱;流動相:乙腈(A),0.2%甲酸水溶液(B),梯度洗脫;柱溫:30℃;流速:1.0mL·min-1;檢測波長:254nm;進(jìn)樣量:50μL。流動相梯度洗脫程序見表1。2.4.2掃描項目及方式大氣壓電噴霧電離源(ElectrosprayIonization,ESI),柱后分流0.5mL·min-1;霧化氣壓力:70psi;干燥氣流速:10.0L·min-1;毛細(xì)管電壓:4kV;傳輸電壓:70V;掃描方式為前3~110min負(fù)離子掃描,后110~125min正離子掃描;掃描范圍:50~1000m/z,再利用離子阱對準(zhǔn)分子離子峰及選定的碎片離子進(jìn)行二級質(zhì)譜(MS2)分析。記錄血清樣品的總離子流圖和質(zhì)譜圖。2.5吸收入血的檢測取桂附地黃丸供試品溶液、空白血清、桂附地黃丸血清樣品在相同的色譜條件下進(jìn)行分析,確定吸收入血的原型成分和代謝產(chǎn)物。利用液相色譜離子進(jìn)阱聯(lián)用技術(shù),分析各自的一、二級離子碎片譜,鑒定出原型成分和代謝產(chǎn)物可能的化學(xué)組成[6~11]。3結(jié)果和分析3.1入血成分分析結(jié)果比較分析桂附地黃丸的體外樣品,給藥后的含藥血清和空白血清樣品,確定有17個入血成分,其中1、2、3、4、5、7、8、9、11、16、17號峰是以原型成分入血。通過DAD檢測器在200~400nm處掃描,將色譜圖中的各化學(xué)成與已知標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖和光譜圖對照,認(rèn)定7號峰的保留時間和紫外光譜與馬錢苷標(biāo)準(zhǔn)品對照一致,11號峰的保留時間和紫外光譜與芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品一致,16號峰的保留時間和紫外光譜與肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)品一致,17號峰的保留時間和紫外光譜與丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品一致(見圖1、2)。此外,本研究在上述HPLC-UV分析的基礎(chǔ)上利用質(zhì)譜對各個入血成分進(jìn)行MS/MS分析,分析各入血成分的一級、二級碎片離子,通過獲得的分子離子峰及其碎片離子等信息,查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料,推測出其他成分可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)。二級質(zhì)譜的主要碎片離子解析如下:1號峰推測為沒食子酸,125[M-H-CO2]-,81[M-H-2CO2]-;4號峰推測為5-羥甲基-2-糠酸,111[M-CH2OH]-,97[M-COOH]-,69[M-COOH-C4H5O]-;5號峰推測為莫諾苷,243[M-H-glu]-;7號峰為馬錢苷227[M-Hglu]-與標(biāo)準(zhǔn)品對照一致;8號峰為羥基芍藥苷,478[M-H-OH]-,465[M-H-CH2O]-;11號峰為芍藥苷,449[M-H-CH2O]-,327[M-H-CH2O-(Benzoicacid)]-;17號峰為丹皮酚,149[M+H-H2O]+,121[M+H-H2OCO]+與標(biāo)準(zhǔn)品對照一致,結(jié)果見表2。3.2可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)通過研究我們還發(fā)現(xiàn)6個代謝產(chǎn)物,它們分別是6、10、12、13、14、15號峰。同法對這6個代謝產(chǎn)物進(jìn)行MS/MS分析,通過獲得的分子離子峰及其碎片離子等信息推測其可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)。二級質(zhì)譜的主要碎片離子解析如下:6號峰推測為2-羥基苯乙酮-4-O-葡萄糖醛酸酯,151[MH-glu]-;10號峰推測為4-甲氧基苯乙酮-2-O-葡萄糖醛酸酯,165[M-H-glu]-;12號峰推測為2,4二羥基苯乙酮-5-O-硫酸酯,167[M-H-SO3]-;13號峰推測為2-羥基-4-甲氧基苯乙酮-5-O-硫酸酯,181[M-H-SO3]-;14號峰推測為2,4-二羥基苯乙酮,109[M-H-CH2CO]-,結(jié)果見表2。4結(jié)果與討論4.1大鼠灌服桂附地黃丸甲醇提取物的血清預(yù)處理方法的優(yōu)化本實驗采用6%高氯酸沉淀蛋白、甲醇沉淀蛋白、乙酸乙脂萃取、SPE固相萃取等方法對大鼠灌服桂附地黃丸甲醇提取物的血清樣品預(yù)處理方法進(jìn)行優(yōu)化、篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6%高氯酸沉淀蛋白法能減少血清中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾,獲取更多的入血成分信息,故確定此方法為本實驗中血清樣品的處理方法。4.2吸收入血成分測定在本實驗基礎(chǔ)上,我們另對桂附地黃丸體內(nèi)入血成分的來源進(jìn)了歸屬,發(fā)現(xiàn)主要來源于熟地黃、山茱萸、澤瀉、丹皮和肉桂這5味生藥,沒有檢測到其余生藥的吸收入血成分。推測其余生藥入血成分在此實驗條件下不能檢出,或者其余生藥不是靠入血成分來發(fā)揮療效,而是通過調(diào)