復(fù)方透皮貼劑抗真菌活性的研究

復(fù)方透皮貼劑抗真菌活性的研究

牛奶乳房炎是奶牛乳房的炎癥反應(yīng)。它會破壞祖母的繁殖功能并使其失效。嚴(yán)重影響牧草的產(chǎn)奶量、乳液質(zhì)量、生殖功能和使用壽命，容易給奶牛和水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。目前,對奶牛乳房炎的治療主要以抗生素和化學(xué)藥物為主,但是由于這類藥物反復(fù)大量使用,造成乳汁中抗生素殘留嚴(yán)重超標(biāo),危害人體健康;同時由于耐藥性菌株增多,增加了臨床上治療的難度,且療效不穩(wěn)定。因此,研制開發(fā)高效、無殘留、無抗藥性、安全低毒的有效藥物就成為乳房炎防治研究的重點(diǎn)。中藥屬于天然制品,含有多種生物有效成分,具有抗菌、消炎、不易使致病菌產(chǎn)生耐藥性、體內(nèi)代謝較快、安全、高效、低毒、無殘留的特點(diǎn),可克服使用抗生素的不足,并兼有藥物與營養(yǎng)劑的雙重功能,因此,利用中藥防治奶牛乳房炎已被國內(nèi)外專家所關(guān)注。安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)臨床獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗室按照中獸醫(yī)辨證施治的理論和奶牛乳房炎的病理特征,研制出一種新型治療奶牛乳房炎的純中藥制劑———中藥復(fù)方透皮貼劑。該試驗旨在探討中藥復(fù)方透皮貼劑的藥效作用,從而為進(jìn)一步探索中藥復(fù)方透皮貼劑的作用機(jī)理和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。1試驗材料1.1試劑的制備七葉一枝花、黃連、紫花地丁、半枝蓮、馬蘭、冰片等中藥;地塞米松注射液、安痛定注射液、氨芐青霉素藥敏片、苦味酸、氫氧化鈉、硫化鈉、二甲苯、伊文思藍(lán)、乙酸、生理鹽水、無水乙醇、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、甘油、羧甲基纖維素鈉、氮酮、丙二醇、聚丙烯酸樹脂壓敏膠等試劑。1.2帶假絲酵母培養(yǎng)基大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、熱帶假絲酵母均由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)臨床獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗室從臨床型乳房炎奶牛乳汁中分離獲得,使用的培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、沙氏瓊脂等培養(yǎng)基。1.3試驗動物1.4試驗設(shè)計和試驗方法1.4.1藥渣、乙醇、水溶液制備稱取七葉一枝花、黃連、紫花地丁、半枝蓮、馬蘭等中藥,混合后用60%乙醇回流提取3次,每次3h。醇提液經(jīng)過濾、回收乙醇、減壓濃縮得藥液Ⅰ。藥渣再用水煎提取2次,每次8倍量水,每次1h。水煎液經(jīng)過濾、離心除雜、減壓濃縮得藥液Ⅱ。藥液Ⅰ和藥液Ⅱ混合,調(diào)節(jié)pH值至6.5~7.5,即得中藥復(fù)方提取濃縮液。冷藏保存?zhèn)溆谩?.4.2在加樣中添加甘油、丙二醇、氮酮、羧甲基纖維素鈉首先精密稱取處方量的聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮,并分別加水溶脹,水浴溶解,混合。另加入處方量的甘油、丙二醇、氮酮、羧甲基纖維素鈉,攪拌均勻。中藥復(fù)方提取濃縮液、冰片用70%乙醇溶解與上述基質(zhì)混合均勻,以流涎工藝在平板玻璃上鋪膜,自然晾干,在藥物的四周涂抹聚丙烯酸樹脂壓敏膠,蓋上防粘紙,切割成規(guī)定大小面積,密封包裝即得透皮貼劑。1.4.3中藥復(fù)方回復(fù)突變試驗取稀釋好的菌液200μL,均勻涂于瓊脂板上,用直徑6mm的打孔器均勻打孔,每板6孔,去除瓊脂并適當(dāng)封底,將中藥復(fù)方提取濃縮液(1gmL)加入其中4孔中,另2孔加貼劑基質(zhì),用氨芐青霉素藥敏片抑菌試驗作陽性對照,每板均勻貼4片。每個試驗菌重復(fù)3次。37℃培養(yǎng)24h,測量其抑菌圈直徑。抑菌圈直徑d(mm)≥20為極敏,22>d≥17為高敏,17>d≥12為中敏,12>d≥8低敏,d<8無抑菌效果。1.4.4不同給藥劑量對耳殼水腫度的影響二甲苯所致小鼠耳腫脹的試驗:健康雄性小鼠50只,隨機(jī)分為5組,分別為a組(空白對照組),基質(zhì)4.0g/kg;b組(陽性對照組),地塞米松注射液0.2mL/只;c組(中藥復(fù)方透皮貼劑Ⅰ組),8.0g/kg;d組(中藥復(fù)方透皮貼劑Ⅱ組),4.0g/kg;e組(中藥復(fù)方透皮貼劑Ⅲ組),2.0g/kg。將a、c、d、e組小鼠頸背脫毛,脫毛面積約1.5cm2,脫毛后次日,將藥物貼于脫毛處,每天1次,連續(xù)5d。b組在試驗第5天皮下注射給藥。每組末次給藥后1h,于小鼠左耳兩側(cè)涂二甲苯0.1mL/只,右耳不涂為正常耳。1h后處死小鼠,剪下左右兩耳,用打孔器(內(nèi)直徑6mm)分別在同一部位取下圓耳片,電子天平稱重,計算耳殼重量,比較各組小鼠耳殼腫脹度(左耳重-右耳重)和耳腫脹率。按下列公式計算出耳腫脹率:耳腫脹率=[(左耳重-右耳重)/右耳重]×100%腹腔注射乙酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性升高的試驗:分組、給藥途徑及方法同上。末次給藥后1h,每只小鼠尾靜脈注射0.5%伊文思藍(lán)生理鹽水溶液0.2mL,并同時腹腔注射0.6%乙酸0.2mL,20min后,脫頸椎處死小鼠,剪開腹腔,用5mL生理鹽水沖洗腹腔,抽出腹腔洗液約4.5mL,2000r/min離心5min,取上清液3mL,在分光光度計590nm處測定吸收度值(A)。1.4.5不同給藥途徑及方法健康雄性小鼠50只,分為5組,分別為a組(空白對照組),基質(zhì)4.0g/kg;b組(陽性對照組),安痛定注射液0.2mL/只;c組(中藥復(fù)方透皮貼劑Ⅰ組),8.0g/kg;d組(中藥復(fù)方透皮貼劑Ⅱ組),4.0g/kg;e組(中藥復(fù)方透皮貼劑Ⅲ組),2.0g/kg。給藥途徑及方法同1.4.4。末次給藥后1h,每只小鼠腹腔注射0.6%乙酸溶液0.2mL/只,觀察并記錄注射乙酸溶液后20min內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)次數(shù),并計算藥物鎮(zhèn)痛率。鎮(zhèn)痛率(%)=[(對照組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù))/對照組扭體次數(shù)]×100%1.5數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析2結(jié)果與分析2.1中藥復(fù)方透皮貼劑提取液對細(xì)菌的生長中藥復(fù)方透皮貼劑提取液對臨床型乳房炎分離菌的體外抑菌效果見表1。由表1可知,中藥復(fù)方透皮貼劑提取液對表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌高敏,對大腸桿菌中敏,對熱帶假絲酵母菌低敏。結(jié)果表明,中藥復(fù)方透皮貼劑提取液對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌具有很好的抑菌效果,對熱帶假絲酵母菌也有一定的抑制作用。2.2中藥復(fù)方透皮貼劑的抗炎效果2.2.1各組小鼠耳殼水腫度和水腫率的比較中藥復(fù)方透皮貼劑對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響結(jié)果見表2。由表2可知,與空白對照組相比,中藥復(fù)方透皮貼劑Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組和地塞米松組小鼠耳殼腫脹度和腫脹率均顯著性降低(P<0.01或P<0.05)。中藥復(fù)方透皮貼劑Ⅰ、Ⅱ組的小鼠耳殼腫脹度和腫脹率差異不顯著(P>0.05),但均極顯著低于中藥復(fù)方透皮貼劑Ⅲ組(P<0.01)。試驗結(jié)果表明,中藥復(fù)方透皮貼劑可抑制二甲苯所致的急性炎癥反應(yīng),具有抗炎作用。2.2.2組皮貼劑、、和的吸光度比較中藥復(fù)方透皮貼劑對小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響結(jié)果見表3。由表3可知,與空白對照組相比,中藥復(fù)方透皮貼劑Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組和地塞米松組的吸光度值均顯著降低(P<0.01或P<0.05)。中藥復(fù)方透皮貼劑Ⅰ、Ⅱ組的吸光度值差異不顯著(P>0.05),但均極顯著低于中藥復(fù)方透皮貼劑Ⅲ組(P<0.01)。結(jié)果表明,中藥復(fù)方透皮貼劑能抑制乙酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的增加,具有較明顯的抗炎作用。2.3中藥復(fù)方透皮貼劑對、組扭體次數(shù)和干預(yù)次數(shù)的影響由表4可知,與空白對照組相比,中藥復(fù)方透皮貼劑Ⅰ、Ⅱ組和安痛定組的扭體出現(xiàn)時間均顯著推遲(P<0.01),扭體次數(shù)也均顯著減少(P<0.01),其鎮(zhèn)痛率分別為52.04%、50.41%和59.67%。中藥復(fù)方透皮貼劑Ⅰ、Ⅱ組的扭體出現(xiàn)時間和扭體次數(shù)差異不顯著(P>0.05),但與中藥復(fù)方透皮貼劑Ⅲ組相比差異顯著(P<0.01)。試驗結(jié)果表明,中藥復(fù)方透皮貼劑對乙酸所致小鼠腹痛具有明顯的抑制作用,且具有鎮(zhèn)痛的效果。3中藥復(fù)方透皮貼劑中獸醫(yī)認(rèn)為,乳房炎是因痰、濕、氣、血郁結(jié)不散,化而為炎,又稱奶腫、奶黃、乳癰等,中藥復(fù)方透皮貼劑是以中草藥為原料制成的純中藥復(fù)方制劑,其主要藥物成分為七葉一枝花、黃連、紫花地丁、半枝蓮、馬蘭、冰片等中藥提取物,其組方具有清熱解毒、抗菌消炎、活血化瘀、消腫止痛、通經(jīng)活絡(luò)之功效,主要用于治療奶牛臨床型乳房炎。3.1中藥復(fù)方透皮貼劑的抗菌作用3.2免疫組化作用該試驗證實(shí),中藥復(fù)方透皮貼劑具有抗炎的作用。現(xiàn)代研究表明,半枝蓮中的漢黃芩素、黃芩苷和黃芩苷元有明顯的抗炎活性,可抑制角叉菜膠引起的小鼠足腫脹。黃連能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞與嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的黏附,從而抑制其向炎癥部位遷移,減少炎性細(xì)胞浸潤,減輕炎癥反應(yīng)。紫花地丁水煎劑在高濃度時可通過下調(diào)白細(xì)胞介素-2、腫瘤壞死因子-α的分泌調(diào)控免疫細(xì)胞功能,從而減少巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)的釋放。馬蘭中的β-谷甾醇(β-sitosterol)具有與氫化可的松和羥基保泰松類似的抗炎作用。冰片的主要成分龍腦與異龍腦對蛋清所致大鼠足跖腫脹和2%巴豆油合劑所致小鼠耳腫脹的炎癥反應(yīng)有抑制作用,其機(jī)制可能是冰片具有頡頏前列腺素和抑制炎性介質(zhì)釋放的作用。由此可知,中藥透皮貼劑的抗炎機(jī)理可能是通過抑制白細(xì)胞趨化、移動及活化分泌炎癥介質(zhì),抑制炎性細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子,抑制組胺、5-羥色胺等引起的毛細(xì)血管通透性增加,抑制滲出和分泌增多或出血,恢復(fù)和提高組織器官的機(jī)能,疏通微循環(huán)、減輕細(xì)菌及其毒素對組織的損傷和破壞等而發(fā)揮抗炎作用。3.3中藥復(fù)方透皮貼劑的抑菌效果昆明系健康小鼠150只,雌雄兼有,體重(20±2)g。計量試驗數(shù)據(jù)以(ue0afX±SD)表示,采用SAS9.1統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。中藥復(fù)方透皮貼劑對乙酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響結(jié)果見表4。葡萄球菌、大腸桿菌和真菌等病原菌是引起奶牛臨床型乳房炎的主要致病菌。通過體外抑菌試驗證實(shí),該中藥復(fù)方透皮貼劑提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌具有較好的抑菌作用,對熱帶假絲酵母菌也有一定的抑制作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),中藥復(fù)方透皮貼劑中的七葉一枝花、黃連、紫花地丁、半枝蓮、馬蘭、冰片均具有體外抑菌作用。七葉一枝花對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有抑制作用。半枝蓮中的芹菜素和木樨草素對青霉素耐藥的金黃色葡萄球菌有殺傷作用。紫花地丁所含黃酮甙類及有機(jī)酸對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鏈球菌等有較強(qiáng)的抑菌作用。黃連不僅對細(xì)菌有抑制作用,對內(nèi)毒素也有很好的抵抗作用,其中,小檗堿、黃連堿和巴馬亭等生物堿均為其抗菌活性成分,對金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、大腸桿菌等具有抑菌作用,而且對耐藥金黃色葡萄球菌的耐藥性具有消除作用。馬蘭中的萜類和黃酮類物質(zhì)對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、普通變形桿菌等均有較強(qiáng)的抗菌作用。冰片中的龍腦、異龍腦和人工合成冰片對金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、大腸桿菌等均有明顯抗菌作用。中藥透皮貼劑中所含的化學(xué)成分復(fù)雜,其抑菌效果有可能是單一成分的作用,也可能是多種成分的協(xié)同作用,這些化學(xué)成分直接作用于細(xì)菌結(jié)構(gòu),干擾細(xì)菌代謝而達(dá)到抑菌效果,其抑菌機(jī)理可能是通過影響細(xì)胞壁的滲透屏障使細(xì)胞質(zhì)外流導(dǎo)致菌體死亡,也可能是透過細(xì)胞壁作用于菌體細(xì)胞膜,引起細(xì)胞膜損傷,破壞改變膜的通透性,或通過抑制細(xì)胞膜上的多種呼吸酶、合成酶阻斷其生物合成而達(dá)到抑菌作用。奶牛乳房炎的臨床表現(xiàn)癥狀主要是炎癥反應(yīng),炎癥是引起奶牛乳腺組織損傷和產(chǎn)奶量下降的主要原因。奶牛乳腺組織是一種十分敏感的組織,當(dāng)乳頭管的管壁受到損傷或受到乳頭管壁上生長的細(xì)菌釋放物質(zhì)的刺激時,即使刺激很小,也能迅速引起乳腺的防御性反應(yīng),從而使乳房炎的發(fā)展進(jìn)入炎癥階段。炎癥的病理過程一般分為三期:早期毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)、滲出和水腫;中期白細(xì)胞游走;晚期結(jié)締組織增生、肉芽腫形成。治療奶牛乳房炎的重點(diǎn)在于有效頡頏急性炎癥的早期階段,即毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)、滲出和水腫階段。該試驗采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹和乙酸致小鼠腹腔毛細(xì)管通透性升高的方法,復(fù)制了早期急性炎癥模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),中藥復(fù)方透皮貼劑對二甲苯所致小鼠耳腫脹的急性炎癥和乙酸所致腹腔毛細(xì)血管通透性升高的急性炎癥均具有明顯的抑制作用(P<0.01或P<0.05),提示中藥復(fù)方透皮貼劑對體液滲出、毛細(xì)血管通透性增大和組織水腫等炎癥過程有明顯的抑制作用。中藥復(fù)方透皮貼劑Ⅰ、Ⅱ組的抗炎效果差異不顯著,但均顯著高于Ⅲ組(P<0.01),表明藥物濃度的高低對該藥物療效存在一定的差異,但并不是隨劑量的增加而呈等倍效果,可能存在一個最佳抗炎濃度。炎癥常常伴有疼痛,炎癥介質(zhì)如組胺、5-羥色胺、緩激肽、白三烯等均可激活傷害性感受器而引起疼痛。疼痛會影響奶牛采食等正常生理活動,劇烈的疼痛會給奶牛造成強(qiáng)烈的刺激,因而影響其內(nèi)分泌等。該試驗采用扭體法測定了中藥復(fù)方透皮貼劑對乙酸所致小鼠疼痛的抑制作用,結(jié)果顯示,中藥復(fù)方透皮貼劑Ⅰ、Ⅱ組的扭體出現(xiàn)時間均顯著推遲(P<0.01)、扭體次數(shù)也均顯著減少(P<0.01),其鎮(zhèn)痛率分別為52.04%和50.41%,說明中藥復(fù)方透皮貼劑對