影響豆粕蛋白質(zhì)消解測(cè)定的關(guān)鍵因素及其控制

影響豆粕蛋白質(zhì)消解測(cè)定的關(guān)鍵因素及其控制

1蛋白溶解度測(cè)定豆餅是鳥(niǎo)類(lèi)的重要食物，也是優(yōu)質(zhì)植物的渣。豆粕質(zhì)量一方面受各種營(yíng)養(yǎng)素含量的影響,如能量、蛋白質(zhì)、纖維素等;另一方面它在很大程度上還受加工程度的影響。適度加熱是豆粕加工的關(guān)鍵,加熱不足或過(guò)度都會(huì)降低豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。尿酶活性測(cè)定值是傳統(tǒng)的用以鑒定豆粕加熱程度的指標(biāo)。但尿酶沒(méi)有負(fù)值,它對(duì)任何過(guò)熟豆粕的最低值均顯示為零。所以它對(duì)評(píng)價(jià)豆粕加熱過(guò)度是無(wú)用的。許多發(fā)達(dá)國(guó)家因此引入了蛋白溶解度的概念。蛋白溶解度是指溶于0.2%KOH溶液中的蛋白質(zhì)占豆粕總粗蛋白質(zhì)含量的百分比。它會(huì)隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯穩(wěn)定地下降。其接近100%,表示豆粕是生的,而低于65%可以肯定是加熱過(guò)度。因此,測(cè)定蛋白溶解度可以克服尿酶活性測(cè)定值的局限性,兩者同時(shí)測(cè)定,可以正確評(píng)估豆粕的加工質(zhì)量,確保豆粕中氨基酸與氨基酸利用率未因加熱過(guò)度或不足而受損。20世紀(jì)60年代末,蛋白質(zhì)溶解度首次被PURANA公司作為評(píng)定豆粕加工適宜度的方法,之后該項(xiàng)技術(shù)基本為私人公司所采用,近十幾年才被發(fā)達(dá)國(guó)家采用,美國(guó)的科研文獻(xiàn)在20世紀(jì)80年代末才開(kāi)始出現(xiàn)對(duì)它的評(píng)估。2001年以來(lái),日本、韓國(guó)、馬來(lái)西亞、印尼等國(guó)家對(duì)我國(guó)向其出口的豆粕也提出增加對(duì)蛋白溶解度的檢測(cè),而我國(guó)尚無(wú)此檢驗(yàn)方法。為滿(mǎn)足國(guó)外要求,我們參考了美國(guó)大豆協(xié)會(huì)提供的蛋白溶解度的測(cè)定方法,并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況,經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)摸索,以解決操作中的一些具體問(wèn)題,得出了一套比較滿(mǎn)意的方法,滿(mǎn)足了出口檢測(cè)要求。2高速高效離心檢測(cè)1093型氣旋磨(帶60目篩網(wǎng));HZS-H型恒溫水浴振蕩器;AND-HM200型電子天平(感量0.0001g);高速離心機(jī);移液管(15mL、50mL);帶蓋離心管(50mL);錐形瓶、容量瓶、燒杯等。其他儀器及用具與粗蛋白測(cè)定相同(SN/T0800·3-1999)。2.2粗蛋白的測(cè)定2.2.10.2%KOH溶液:稱(chēng)取2.873g純度為82%的分析純K0H,加水溶解,定容至1000mL(該溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配)。2.2.2其他試劑:同粗蛋白測(cè)定(SN/T0800.3-1999)。2.3.1將待測(cè)樣品粉碎,使之全部通過(guò)60目標(biāo)準(zhǔn)篩,混合均勻。2.3.2稱(chēng)取1.5000±0.0002g樣品于250mL錐形瓶中,準(zhǔn)確加入75mL新配制的0.2%KOH溶液,立即置于18℃左右的恒溫水浴振蕩器上,在約170r/min的轉(zhuǎn)速下振蕩20min。2.3.3移取2.3.2溶液50mL于離心管中,以2700r/min的速度離心10min;2.3.4將上清液到入小燒杯中,準(zhǔn)確移取15mL上清液至消化管內(nèi)。2.3.5以下按照粗蛋白的測(cè)定步驟測(cè)定堿溶蛋白P1,注意應(yīng)將其置于消化塊上之后由室溫開(kāi)始升溫消化,以免液體爆沸,同時(shí)測(cè)定豆粕粗蛋白P。粗蛋白的測(cè)定參照SN/T0800.3-1999。《進(jìn)出口糧食、飼料粗蛋白質(zhì)檢驗(yàn)方法》。2.4移樣質(zhì)量的測(cè)定0.014——每毫摩爾質(zhì)量氮的克數(shù)K——氮換算成蛋白質(zhì)的系數(shù),(此處取K=6.25)m——試樣的質(zhì)量,g50/75;15/50——移取樣液的體積比堿溶蛋白P1的平行試驗(yàn)允許誤差參照粗蛋白的要求(SN/T0800·3-1999)。堿溶蛋白P1及粗蛋白P均取平行試驗(yàn)結(jié)果的算術(shù)平均值作為結(jié)果,保留三位小數(shù),最終蛋白溶解度Ps的結(jié)果保留兩位小數(shù)。3結(jié)果與討論在測(cè)定豆粕蛋白質(zhì)溶解度的過(guò)程中,有一些因素會(huì)對(duì)其測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生較大影響,注意對(duì)這些關(guān)鍵點(diǎn)加以控制,可獲得較好的準(zhǔn)確度和精密度。3.1蛋白溶解度測(cè)定豆粕樣品的粉碎粒度會(huì)影響其蛋白質(zhì)溶解度的值,隨粒度的縮小蛋白質(zhì)溶解度的值會(huì)增大,當(dāng)粒度過(guò)60目篩后,蛋白溶解度趨于定值。因此,測(cè)定蛋白質(zhì)溶解度時(shí)的堿溶蛋白和粗蛋白的待測(cè)樣品比較合理的制樣粒度應(yīng)控制在全部通過(guò)60目標(biāo)準(zhǔn)篩。測(cè)定堿溶蛋白時(shí),由于加入的75mL0.2%KOH溶液的量是固定的,故平行樣品的稱(chēng)樣應(yīng)準(zhǔn)確在1.5000±0.0002g范圍內(nèi),以確保其較高的重現(xiàn)性。3.30.koh的純度3.3.10.2%KOH溶液的配制美國(guó)大豆協(xié)會(huì)提供的方法,要求KOH溶液的濃度為0.2%,相當(dāng)于0.042當(dāng)量、pH值為12.5。以配制1000mL0.2%KOH溶液為例,應(yīng)稱(chēng)取KOH2.356g,但市售的分析純的KOH一般純度為≥82%,如以82%為基準(zhǔn),則折算純度后實(shí)際應(yīng)該稱(chēng)取KOH2.873g,故在稱(chēng)量KOH時(shí)應(yīng)先對(duì)其純度進(jìn)行折算。3.3.20.2%KOH溶液的放置時(shí)間配制好的KOH溶液如果沒(méi)有一次性用完,那么放置了一段時(shí)間的KOH溶液是否會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響呢?我們對(duì)同一樣品進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)。A組采用新配制的KOH溶液,B組采用放置一天的KOH溶液,結(jié)果(見(jiàn)表1)表明,同一樣品的粗蛋白含量變化基本不大,但B組相對(duì)于A組的堿溶蛋白數(shù)值減小,造成最終蛋白質(zhì)溶解度的值偏低。我們分析可能是實(shí)驗(yàn)室中的某些酸性氣體對(duì)其濃度造成一定影響。故建議測(cè)定采用現(xiàn)配制的0.2%KOH溶液為宜。3.4振蕩溫度和時(shí)間的確定為熱受溫度條件優(yōu)化配置了時(shí)間和轉(zhuǎn)速、時(shí)間、溫度美國(guó)大豆協(xié)會(huì)提供的方法要求將75mL0.2%KOH溶液加入到樣品中后,置于磁力攪拌器上攪拌20min。但目前本實(shí)驗(yàn)室只有一臺(tái)磁力攪拌器,檢測(cè)多個(gè)樣品時(shí),勢(shì)必會(huì)影響檢測(cè)效率,且攪拌速度不穩(wěn)定,造成平行樣品的重現(xiàn)性較差。我們認(rèn)為采用此步驟的目的是在盡量短的時(shí)間內(nèi),使蛋白質(zhì)充分溶解在0.2%KOH溶液中,我們采用恒溫水浴振蕩器同樣達(dá)到了比較滿(mǎn)意的效果,且一次可同時(shí)振蕩多達(dá)十個(gè)樣品,既提高了檢測(cè)速度,又提高了平行樣品的重現(xiàn)性。以下是對(duì)恒溫振蕩器試驗(yàn)條件的摸索。3.4.1轉(zhuǎn)速在室溫的條件下,分別以130、140、150、160、170、180、190、200r/min的轉(zhuǎn)速對(duì)同一樣品振蕩20min,結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知:在130、140r/min時(shí),雖然平行性較好,但結(jié)果偏低;190、200r/min時(shí)由于轉(zhuǎn)速過(guò)高,有時(shí)部分樣品會(huì)粘在瓶壁上造成溶解不完全,導(dǎo)致結(jié)果平行性較差;而采用150~180r/min時(shí)可保證其較高的精密度和相對(duì)穩(wěn)定的數(shù)據(jù)結(jié)果,因此我們選擇了170r/min左右的轉(zhuǎn)速進(jìn)行振蕩。3.4.2振蕩時(shí)間在室溫條件下,以170r/min左右的轉(zhuǎn)速對(duì)同一樣品摸索了振蕩時(shí)間的影響,結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,振蕩時(shí)間不夠時(shí),溶解不充分,造成堿溶蛋白數(shù)值偏低,而20min以后相對(duì)穩(wěn)定,當(dāng)然過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的劇烈振蕩也會(huì)引起蛋白質(zhì)變性,故我們采用20min的振蕩時(shí)間。3.4.3溫度控制在摸索振蕩的轉(zhuǎn)速和時(shí)間時(shí),都是在室溫條件下進(jìn)行的,但室溫也是時(shí)常發(fā)生變化的,那么測(cè)定蛋白質(zhì)溶解度時(shí)是否應(yīng)適當(dāng)控制振蕩溫度呢,我們進(jìn)行了如下試驗(yàn):對(duì)同一豆粕樣品分別于14℃、16℃、18℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃恒溫水浴內(nèi),以170r/min的轉(zhuǎn)速振蕩20min,結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可以看出,隨溫度的升高,堿溶蛋白的值也逐漸升高,這種趨勢(shì)十分明顯,說(shuō)明在蛋白質(zhì)變性之前的溫度范圍內(nèi),環(huán)境溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度有一定的影響。當(dāng)?shù)竭_(dá)變性區(qū)域后,由于美拉德等反應(yīng)的影響,蛋白溶解度會(huì)隨溫度的升高,加熱的延長(zhǎng)而下降。經(jīng)與權(quán)威實(shí)驗(yàn)室對(duì)比后發(fā)現(xiàn),振蕩溫度控制在18℃左右得到的數(shù)據(jù)比較合理。3.5準(zhǔn)確度和精密度經(jīng)過(guò)多次對(duì)比,采用上述方法測(cè)定豆粕中蛋白溶解度得到的結(jié)果數(shù)據(jù)與權(quán)威實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果數(shù)據(jù)十分接近,說(shuō)明該方法測(cè)得的分析結(jié)果比較可靠。3.5.2精密度蛋白溶解度Ps的值是通過(guò)堿溶蛋白P1和粗蛋白P的值得出的,粗蛋白P的測(cè)定用經(jīng)典法,其精密度不必再討論,故對(duì)蛋白溶解度平行性的考察主要是針對(duì)堿溶蛋白P1的。我們?nèi)∫痪鶆虻挠写硇缘臉悠?按該方法平行測(cè)定10次,其堿溶