研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的主要方法

引言在許多的細(xì)胞生命活動(dòng)中，例如DNA復(fù)制、mRNA轉(zhuǎn)錄與修飾以及病毒的感染等都涉及到DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用的問(wèn)題。

重組DNA技術(shù)的發(fā)展，人們已分離到了許多重要的基因?，F(xiàn)在的關(guān)鍵問(wèn)題是需要揭示環(huán)境因子及發(fā)育信號(hào)究竟是如何控制基因的轉(zhuǎn)錄活性。為此需要：

a、鑒定分析參與基因表達(dá)調(diào)控的DNA元件；

b、分離并鑒定這些順式元件特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)因子；

這些問(wèn)題的研究都涉及到DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。

研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)方法主要包括：

a、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)；b、DNase1足跡實(shí)驗(yàn)；

c、甲基化干擾實(shí)驗(yàn)；d、體內(nèi)足跡實(shí)驗(yàn)；f、拉下實(shí)驗(yàn)。

二、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)

1、概念：凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（Gelretardationassay），要叫做DNA遷移率變動(dòng)試驗(yàn)（DNAmobilityshiftassay）或條帶阻滯實(shí)驗(yàn)（Bandretardationassay）是在八十年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。

2、原理：

在凝膠電泳中，由于電場(chǎng)的作用，裸露的DNA分子向正電極移動(dòng)距離的大小是同其分子量的對(duì)數(shù)成反比。如果某種DNA分子結(jié)合上一種特殊的蛋白質(zhì)，那么由于分子量的加大它在凝膠中的遷移作用便會(huì)受到阻滯，于是朝正極移動(dòng)的距離也就相應(yīng)的縮短，因而在凝膠中出現(xiàn)滯后的條帶，這就是凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的基本原理。

3、過(guò)程:

1)首先制備細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物（理論上其中含有某種特殊的轉(zhuǎn)錄因子）

2)用放射性同位素標(biāo)記待檢測(cè)的DNA片段（含有轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)）

3)這種被標(biāo)記的探針DNA同細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物一起進(jìn)行溫育，于是產(chǎn)生DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物

4)在控制使DNA-蛋白質(zhì)保持結(jié)合狀態(tài)的條件下，進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

5)最后進(jìn)行放射自顯影，分析電泳結(jié)果

4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析：

a、如果有放射性標(biāo)記的條帶都集中于凝膠的底部，這就表明在細(xì)胞提取物中不存在可以同探針DNA相互結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)；

b、如果在凝膠的頂部出現(xiàn)放射性標(biāo)記的條帶，這就表明細(xì)胞提取物存在可與探針DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)。

5、DNA競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)：

DNA競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)（DNAcompetitiveassay）的具體做法如下：

在DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合的反應(yīng)體系中加入了超量的非標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)DNA（competitorDNA），如果它同探針DNA結(jié)合的是同一種轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)，那么由于競(jìng)爭(zhēng)DNA與探針DNA相比是極大超量的，這樣絕大部分轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)都會(huì)被競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合掉，而使探針DNA仍然處于自由的非結(jié)合狀態(tài)，可以在電泳凝膠的放射自顯影圖片上就不會(huì)出現(xiàn)阻滯的條帶；

如果反應(yīng)體系中加入的競(jìng)爭(zhēng)DNA并不能同探針DNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合同一種轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果在電泳凝膠中的放射自顯影圖片上就會(huì)出現(xiàn)阻滯的條帶。

6、應(yīng)用：

a、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)可以用于鑒定在特殊類型細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物中，是否存在能同某一特定的DNA（含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)）結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)；

b、DNA競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)可以用來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)同DNA結(jié)合的精確序列部位；

c、通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)DNA中轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的堿基突變可以研究此種突變競(jìng)爭(zhēng)性能及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合作用的影響；

d、也可以利用DNA同特定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合作用通過(guò)親和層析來(lái)分離特定的轉(zhuǎn)錄因子。

三、足跡實(shí)驗(yàn)

1、定義:

足跡實(shí)驗(yàn)（foot-printingassay），是一種用來(lái)檢測(cè)被特定轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的DNA序列的位置及其核苷酸序列結(jié)構(gòu)的專門實(shí)驗(yàn)方法。

2、原理：當(dāng)DNA分子中的某一區(qū)段同特異的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合之后便可以得到保護(hù)而免受DNaseI酶的切割作用，而不會(huì)產(chǎn)生出相應(yīng)的切割分子，結(jié)果在凝膠電泳放射性自顯影圖片上便出現(xiàn)了一個(gè)空白區(qū)，俗稱為“足跡”。

3過(guò)程：將待檢測(cè)的雙鏈DNA分子在體外用32P作5‘末端標(biāo)記，并用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切出其中的一個(gè)末端，于是便得到了一條單鏈末端標(biāo)記的雙鏈DNA

在體外同細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物（細(xì)胞核提取物也可以）混合，形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體

在反應(yīng)混合物中加入少量的DNaseI,并控制用量使之達(dá)到平均每條DNA鏈，只發(fā)生一次磷酸二酯鍵的斷裂：

a、如果蛋白質(zhì)提取物中不存在與DNA結(jié)合的特定蛋白質(zhì)，使DNaseI消化之后，便會(huì)產(chǎn)生出距離放射性標(biāo)記末端1個(gè)核苷酸，2個(gè)核苷酸，3個(gè)核苷酸------等等一系列前后長(zhǎng)度均相差一個(gè)核苷酸的不間斷的連續(xù)的DNA片段梯度群體；

b、如果DNA分子同蛋白質(zhì)提取物中的某種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，被結(jié)合部位的DNA就可以得到保護(hù)免受DNaseI酶的降解作用；

除去蛋白，加樣在20%序列膠上進(jìn)行電泳分離，實(shí)驗(yàn)分兩組:

a、實(shí)驗(yàn)組：DNA+蛋白質(zhì)混合物

b、對(duì)照組：只有DNA，未與蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行溫育

最后進(jìn)行放射性自顯影，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4、結(jié)果判斷:

實(shí)驗(yàn)組凝膠電泳顯示的序列，出現(xiàn)空白的區(qū)域表明是轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合部；與對(duì)照組序列比較，便可以得出蛋白質(zhì)結(jié)合部位的DNA區(qū)段相應(yīng)的核苷酸序列。

5、其他的足跡實(shí)驗(yàn)方法：

除了DNase1足跡試驗(yàn)之外，目前還發(fā)展出了若干種其他類型的足跡實(shí)驗(yàn)，例如：

a、自由羥基足跡實(shí)驗(yàn)；b、菲咯啉銅足跡實(shí)驗(yàn)；c、DMS(硫酸二甲酯)足跡實(shí)驗(yàn)

DMS(硫酸二甲酯)足跡實(shí)驗(yàn)的原理

DMS能夠使DNA分子中裸露的鳥(niǎo)嘌呤（G）殘基甲基化，而六氫吡啶又會(huì)對(duì)甲基化的G殘基作特異性的化學(xué)切割。如果DNA分子中某一區(qū)段同轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，就可以避免發(fā)生G殘基的甲基化而免受六氫吡啶的切割作用。

四、甲基化干擾實(shí)驗(yàn)

1、概念：

甲基化干擾實(shí)驗(yàn)（Methylationinterferenceassay）是根據(jù)DMS（硫酸二甲酯）能夠使DNA分子中裸露的鳥(niǎo)嘌呤（G）殘基甲基化，而六氫吡啶又會(huì)對(duì)甲基化的G殘基作特異性的化學(xué)切割這一原理設(shè)計(jì)的另一種研究蛋白質(zhì)同DNA相互作用的實(shí)驗(yàn)方法。

應(yīng)用這種技術(shù)可以檢測(cè)靶DNA中G殘基的優(yōu)先甲基化，對(duì)爾后的蛋白質(zhì)結(jié)合作用究竟會(huì)有仔細(xì)檢查抗體的說(shuō)明書(shū)。特別是多抗的特異性是問(wèn)題。其次，要注意溶解抗原的緩沖液的性質(zhì)。多數(shù)的抗原是細(xì)胞構(gòu)成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強(qiáng)界面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合。另一面，如用弱界面活性劑溶解細(xì)胞，就不能充分溶解細(xì)胞蛋白。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結(jié)合的結(jié)果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結(jié)合，即使IP成功，也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結(jié)果。再次，為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每次實(shí)驗(yàn)之前，首先考慮抗體/緩沖液的比例。抗體過(guò)少就不能檢出抗原，過(guò)多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過(guò)多則抗原被稀釋。ChIP的一般流程：甲醛處理細(xì)胞---收集細(xì)胞，超聲破碎---加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復(fù)合物相互結(jié)合---加入ProteinA，結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復(fù)合物，并沉淀---對(duì)沉淀下來(lái)的復(fù)合物進(jìn)行清洗，除去一些非特異性結(jié)合---洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物---解交聯(lián)，純化富集的DNA-片斷---PCR分析。在PCR分析這一塊，比較傳統(tǒng)的做法是半定量-PCR。但是現(xiàn)在隨著熒光定量PCR的普及，大家也越來(lái)越傾向于Q-PCR了。此外還有一些由ChIP衍生出來(lái)的方法。例如RIP（其實(shí)就是用ChIP