微生物檢驗(李魯平)

臨床微生物學檢驗沈陽市第六人民醫(yī)院李魯平電話：23393138E-mail：luping4758@163.com10/4/20231臨床標本的采集與處理細菌形態(tài)學檢查細菌的分離培養(yǎng)與接種技術細菌生化反應鑒定的理論基礎醫(yī)院感染的實驗診斷抗菌藥物敏感性試驗10/4/20232一、微生物檢查基本方法10/4/20233致病菌的檢驗程序標本直接涂片染色鏡檢分離培養(yǎng)與鑒定病原菌抗原檢測其它檢測形態(tài)、結構、染色性涂片鏡檢菌落特征生化反應藥敏試驗血清學反應沉淀反應協(xié)同凝集免疫熒光對流免疫電泳酶免疫測定免疫印跡細菌代謝產(chǎn)物（氣相色譜）細菌核酸（PCR）噬菌體分離細菌素測定分子生物學技術動物試驗10/4/20234一、微生物檢查基本方法與診斷技術

(一)

細菌形態(tài)學檢查法:1.顯微鏡檢查法:①普通光學顯微鏡：②

暗視野顯微鏡：③

相差顯微鏡：④

熒光顯微鏡：⑤

電子顯微鏡：2.細菌標本染色法;①單染色法:用一種染料將細菌和周圍物體染成同一種染色。②復染色法:用兩種或兩種以上染料染色的方法革蘭染色；抗酸染色；10/4/20235(二)

細菌的人工培養(yǎng)及生化實驗1.細菌的人工培養(yǎng)法

①培養(yǎng)基:根據(jù)用途分基礎培養(yǎng)基、營養(yǎng)培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、特殊培養(yǎng)基。根據(jù)物理性狀分液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。②

細菌接種法:③細菌培養(yǎng)法:需氧培養(yǎng);厭氧培養(yǎng);二氧化碳培養(yǎng);微需氧培養(yǎng)。10/4/202362.細菌生物化學實驗方法、種類及原理

①

糖分解產(chǎn)物實驗糖發(fā)酵試驗;葡萄糖代謝類型鑒別試驗;七葉苷水解試驗;淀粉水解實驗;甲基紅試驗;V-P試驗;ONPG試驗.

②

蛋白質分解產(chǎn)物試驗明膠液化試驗;吲哚試驗;硫化氫試驗;尿素酶試驗;苯丙氨酸脫氨酶試驗;氨基酸脫羧酶試驗.③碳源利用試驗枸櫞酸鹽利用試驗,丙二酸鹽利用試驗.④呼吸酶類試驗氧化酶試驗;觸酶試驗;硝酸鹽還原試驗.⑤其他生化試驗脂酶試驗;磷酸酶試驗;DNA試驗;凝固酶實驗；膽汁溶菌試驗10/4/20237細菌L型生長緩慢，營養(yǎng)要求高，對滲透壓敏感，普通營養(yǎng)基上不能生長，培養(yǎng)時必須用高滲的含血清的培養(yǎng)基。細菌L型在高滲的含血清的培養(yǎng)基上生長后形成三種類型的菌落。

(三)

細菌L型的概念及檢查法10/4/20238二、微生物學檢驗概述

(一)標本采集種類與原則1)血液：一般在病人發(fā)熱初期或高峰期采集，懷疑細菌性心內膜炎時，血培養(yǎng)不少于三次。一般為靜脈血，成人采血量10—20ml，嬰兒和兒童1—2ml。2)尿液：最好用導尿管收集尿液，要防止逆行性感染。3)糞便：取膿血或粘液的糞便置清潔容器中送檢。排便困難者，可用直腸拭子采樣。4)鼻咽拭子：5)痰：清晨第一口痰為宜，必須先用清水漱口，避免唾液混入。10/4/202396)腦脊液及其他：CSF應無菌操作進行腰椎穿刺；胸水、腹水、包液、滑囊液等用注射器無菌操作采集。7）眼,耳部標本：用無菌拭子采集，及時接種相應培養(yǎng)基。8)性傳播疾病標本：男性采取尿道膿性分泌物，女性采取宮頸分泌物，供鏡檢及培養(yǎng)；梅毒取皮膚滲出物和淋巴穿刺液涂片；皰疹取皰內液體或刺破小皰后，用無菌拭子采樣。9)創(chuàng)傷、組織、膿腫標本：根據(jù)不同部位采取不同標本。10/4/202310標本運送1）采集時間應在疾病早期,急性期,癥狀典型或用藥之前采集標本.2）根據(jù)不同目的采用不同的采集方法.3）除痰,大便,肛拭子等體外標本,其他標本采集時應用無菌操作,采集量不得過少.4）最好床邊接種.(保溫,冷藏,厭氧或種入運送培養(yǎng)基內).5)采集運送時必須注意安全,防止污染及交叉感染.10/4/202311（二）微生物學檢查接到標本后立即進行微生物學檢查.1.

直接鏡檢：標本經(jīng)涂片染色或制備濕片鏡檢。2.

快速診斷：快速檢測病原體成分主要是指特異性抗原和核酸檢測.特異性抗原檢測包括免疫熒光技術,膠乳凝集試驗,酶免疫技術,對流免疫電泳,化學發(fā)光免疫測定等.

3.

直接藥敏試驗：直接將標本接種于平板，用抗生素紙片作藥物敏感試驗，在18—24h內可獲得結果。

4.

常規(guī)檢驗：1)分離培養(yǎng)：通常由正常無菌部位采取的標本接種血平板，置空氣或5%—10%二氧化碳的氣缸中培養(yǎng)，大部分細菌可于24—48h生長良好。2)鑒定：分離出的細菌一般經(jīng)過細菌形態(tài),菌落特點,生化反應,血清學試驗,動物接種等鑒定。10/4/202312

3)體外純菌藥物敏感性試驗:包括抑菌試驗,殺菌試驗,聯(lián)合藥敏試驗和檢測細菌產(chǎn)生的抗生素滅活酶等。4)報告:直接鏡檢要求2小時報告,說明標本合格,發(fā)現(xiàn)微生物情況和特點;初步鑒定和直接藥敏結果于24小時或次晨報告,報告可能的病原菌和直接藥敏結果;最后鑒定和細菌藥敏結果一般不超過3天。

5.血清學診斷:是指用已知抗原或已知抗體檢測患者血清中相應抗體或抗原的方法。血清學凝集試驗：采用含有已知特異性抗體的血清與分離培養(yǎng)出的未知純種細菌或標本種的抗原進行血清學反應,以確定病原菌的種或型。10/4/202313臨床微生物實驗室安全措施和質量保證

1.

感染性廢棄物的處理1)去污染,任何污染材料未經(jīng)消毒不能拿出實驗室.2)液體廢棄物必須收集在防漏,未破的容器內,經(jīng)高濃度的化學消毒劑處理.3)對剩余的標本,接種過的培養(yǎng)基,菌種等丟棄前均須消毒.4)對于任何有污染的銳器如針頭,注射器,玻片等在處理前不要用手接觸.10/4/2023142.微生物實驗室的室內質控

1)

對細菌檢驗人員的要求;2)

操作手冊;3)

儀器設備的功能監(jiān)測;4)

培養(yǎng)基的質量控制;5)

試劑,染色液以及抗血清的質量控制;6)

標本檢驗的質量控制;7)

標準菌株的來源和保存及室內質量的全面控制.

微生物檢驗的室間質評10/4/2023151.微生物檢查基本方法與診斷技術。2.微生物學檢驗概述。內容小結10/4/202316二、臨床常見的微生物及檢驗方法(例）10/4/202317一、球菌

葡萄球菌(一)

生物學特性1.

形態(tài)與結構：本菌屬G染色陽性,呈圓球形,不規(guī)則成堆排列,形似葡萄串狀,無莢膜.無鞭毛和芽孢.2.

培養(yǎng)特性：需氧或兼性厭氧,營養(yǎng)要求不高.最適PH為7.4,經(jīng)37℃24—48h培養(yǎng),可形成圓形,凸起,表面光滑濕潤,邊緣整齊不透明的菌落,可產(chǎn)生不同的脂溶性色素,如白色,金黃色,檸檬色色素。在血平板上,幾乎所有的葡萄球菌可產(chǎn)生α,β,γ和δ溶血在液體培養(yǎng)基中生長迅速生長呈均勻混濁狀.10/4/202318

3)分類方法：根據(jù)其在固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生的不同色素分為金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌和檸檬色葡萄球菌。1965年,國際葡萄球菌和微球菌分類委員會將葡萄球菌分為凝固酶陽性和陰性葡萄（CNS）。CNS包括表葡、腐生葡萄球菌。凝固酶陽性葡萄球菌包括金葡、中間型和家畜葡萄球菌。

(二)

微生物檢查

1.標本采集:膿汁,滲出液,分泌物,血,尿,糞便,痰液及腦脊液。2.檢查方法及鑒定10/4/202319

1)直接鏡檢涂片,G染色鏡檢,如為陽性球菌呈葡萄狀排列可初診.初報為找到G陽性葡萄狀排列球菌,疑為葡萄球菌。

2)分離培養(yǎng)膿汁,尿液.腦脊液等離心沉淀,可直接接種血平板。37℃18—24h培養(yǎng)可產(chǎn)生不同色素的菌落.金黃色葡萄球菌在周圍有透明溶血環(huán).3)鑒定試驗a.觸酶試驗：細菌產(chǎn)生的過氧化氫酶催化雙氧水生成水和氧氣,產(chǎn)生氣泡.b.血漿凝固酶試驗：血漿凝固酶是金黃色葡萄球菌所產(chǎn)生的一種與其致病力有關的侵襲性酶,分游離型和結合型。其作用是血漿中的纖維蛋白在菌體表面沉積和凝固以阻礙吞噬細胞的吞噬。10/4/202320c.甘露醇發(fā)酵試驗d.新生霉素敏感試驗凝固酶陰性的葡萄球菌：敏感為表皮葡萄球菌;耐藥為腐生葡萄球菌。e.同時進行體外藥物敏感試驗本唑西林：MSS/MRSβ-內酰胺酶萬古酶素的敏感性。

金黃色葡萄球菌:觸酶+凝固酶+甘露醇+新生酶素S表皮葡萄球菌:+-+S腐生葡萄球菌:+-+R報告:檢出XXX葡萄球菌10/4/2023214)耐藥性檢測:耐甲氧西林金葡菌（MRSA），

耐甲氧西林的表葡菌（MRSE）。5)

臨床意義：葡萄球菌感染的特點是感染部位組織的化膿，壞死和膿腫形成。金葡，表葡和腐生葡萄球菌是引起臨床感染最常見的葡萄球菌。①金葡菌引起癤，癰，外科傷口，創(chuàng)傷的局部化膿性感染，入血后可引起深部組織的化膿性感染。其產(chǎn)生的腸毒素可引起食物中毒，表現(xiàn)為急性胃腸炎。主要致病物質有血漿凝固酶，葡萄球菌溶血素，殺WBC素，腸毒素，表皮溶解毒素和毒性休克綜合癥毒素②

表葡是存在于皮膚的正常菌群，由于各種導管植入和人造組織的使用，該菌已成為醫(yī)院感染的重要病原菌，是導致血培養(yǎng)污染的常見菌之一。③

腐生葡萄球菌是導致尿路感染的常見菌之一。10/4/202322四、醫(yī)院感染與抗菌藥物敏感性試驗10/4/202323一、醫(yī)院獲得性感染(hospitalacquiredinfection)：包括醫(yī)院內各種人群所獲得的感染。對象——一切在醫(yī)院內活動的人群（主要為住院病人）地點——感染發(fā)生必須在醫(yī)院內時間——病人在住院期間或出院后不久發(fā)生的感染，及與前次住院有關的感染。一、醫(yī)院感染10/4/202324

醫(yī)院感染的類型按微生物來源內源性醫(yī)院感染——由自身正常菌群轉變成機會性致病菌所致特定條件——寄居部位改變

——免疫功能下降

——菌群失調外源性醫(yī)院感染（交叉感染）——患者遭受醫(yī)院內非自身存在的病原體侵襲而發(fā)生的感染。病人之間、醫(yī)患之間、污染醫(yī)護用品或診治設備、環(huán)境空氣等，也稱醫(yī)院內感染。按感染部位分類——全身各部位均可發(fā)生10/4/202325

易感宿主：主要是原發(fā)病引起機體抵抗力低下，接受影響免疫功能的藥物治療或接受侵襲性操作措施的病人。這些病人主要表現(xiàn)為局部或全身免疫功能受損，正常菌群被破壞，抑制外部細菌定植能力減弱或消失，使病人處于高度易感狀態(tài)。

醫(yī)院感染常見的微生物主要是機會性致病菌（常為內源性感染）常為耐藥菌;新的病原菌不斷出現(xiàn);主要是細菌，其次為病毒和真菌。常見的微生物有：1．細菌葡萄球菌屬、微球菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌科、假單胞菌屬、不動桿菌屬、軍團菌、腦膜炎敗血性黃桿菌、結核桿菌、李斯特菌、類桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風桿菌、核梭桿菌、丙酸桿菌、消化球菌等。10/4/202326

2．真菌念珠菌、組織胞漿菌、球孢子菌、隱球菌、曲霉菌等。3．病毒肝炎病毒、水痘病毒、流感病毒、輪狀病毒、單純皰疹病毒、巨細胞病毒等。4．對于機體的不同系統(tǒng)，醫(yī)院感染的病原菌也不同，

目前G陰性桿菌仍占主要地位，凝固酶陰性葡萄球菌及腸球菌感染率逐漸上升，尤其應該注意的是MRSA及耐萬古霉素腸球菌引起的醫(yī)院感染。10/4/202327二、監(jiān)控抗感染治療的實驗室方法

(一)

抗菌藥物選擇原則：合理使用抗生素，應根據(jù)病原學及其藥敏試驗結果，結合抗生素的性能，藥理學情況及患者生理、病理、免疫狀態(tài)合理選用抗生素。(二)

抑菌試驗原理及方法目前常用的方法是紙片瓊脂擴散法，是一種半定量的方法。美國CLSI(NCCLS)紙片擴散法敏感試驗分委會所推薦的標準方法是K—B法，此法是目前公認的標準實驗方法。10/4/202328

紙片瓊脂擴散法

原理將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種待檢菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后會不斷地向紙片周圍區(qū)擴散，形成遞減的剃度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內待檢菌的生長被抑制，從而產(chǎn)生透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反應檢測菌對測定藥物的敏感程度，并與該菌對待檢菌的最低抑菌濃度呈負相關。試驗方法在純培養(yǎng)平板上挑取相同的菌落4-5個。用無菌生理鹽水調菌液為0.5麥氏單位（約含菌１Ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ），在15min內接種完。10/4/202329用無菌棉試蘸取菌液，在試管壁上擠壓幾次，壓去多余的菌液，分三個方向即每次旋轉平板60°,使整個MH平板涂布均勻.涂布菌液的平板于室溫中干燥3-5min后,用紙片分配器或無菌鑷子取藥敏紙片,貼于平板表面,并用鑷尖輕壓一下紙片,使其貼平.每張紙片的間距不小于24mm,紙片的中心距平板的邊緣不小于15mm,90mm直徑的平板宜貼6張藥敏紙片.將貼好紙片的平板置35℃孵育18-24h后,用標尺量取抑菌圈直徑.結果判斷根據(jù)量取抑菌圈的直徑（包含紙片的直徑），以毫米數(shù)報告（取整數(shù)）。(不同抗生素其抑菌圈大小的標準不一致),判斷為敏感(S)、耐藥(R)或中度敏感結果判讀。10/4/202330結果報告敏感（susceptible，S）：是指當使用常規(guī)推薦劑量的抗菌藥物進行治療時，該抗菌藥在患者感染部位所能達到的濃度可抑制該感染菌的生長。耐藥（resistant，R）：是指使用常規(guī)推薦劑量的抗菌藥物進行治療時，該抗菌藥在患者感染部位通常所能達到的濃度不能抑制該感染菌的生長；或者該藥對該感染菌的臨床療效尚未在以往的治療研究中被證實是可靠的；或者抑菌圈直徑落在特定細菌發(fā)揮耐藥機制（如β-內酰胺酶）的合適范圍。10/4/202331中介（intermesiate，I）抗菌藥對感染菌的MIC接近該藥在血液和組織中的濃度，感染菌的臨床應答率可能低于敏感菌。根據(jù)藥代動力學資料分析，若某藥在生理濃集部位具有臨床效力，如尿中喹諾酮類和β-內酰胺酶類藥物濃度較高，則中介意味著該藥治療該部位的感染可能有效；于之相反，若某藥由于通透性等原因在某個組織、器官或體液中濃度較低，甚至在炎癥的情況下濃度亦較低，如一些藥在腦脊液中，則中介意味著盡可能不用該藥進行治療，而應選用其他有效藥物.10/4/202332若某藥在高劑量使用時是安全的（如β-內酰胺酶藥物），則中介意味著高劑量給藥可能奏效在判斷藥敏試驗結果時，中介的數(shù)據(jù)位置處于敏感與耐藥之間，它可作為一個緩沖帶，用以防止因為一些小的、不能控制的技術因素而引起的結果解釋的偏差，特別對于那些藥毒范圍（pharmacotoxicitymargin）較窄的藥物來講這個緩沖帶相當重要。10/4/202333局限性：體外試驗敏感的，體內不一定敏感。細菌室分離的病原菌不一定都是致病菌我國采用的藥敏試驗標準為