實驗五 轉(zhuǎn)化及重組子的篩選

實驗五轉(zhuǎn)化及重組子的篩選一、實驗?zāi)康?/p>

了解細(xì)胞轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義；學(xué)習(xí)外源DNA轉(zhuǎn)化入受體菌細(xì)胞并篩選轉(zhuǎn)化體的方法。二、實驗原理

轉(zhuǎn)化（transformation）是將異源DNA分子導(dǎo)入另一細(xì)胞品系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段。其原理是細(xì)菌處于0℃，

CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時間熱擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)，實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞表現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化體(transformant)，即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞。基因?qū)敕椒?1)電擊法(Genetransferbyelectroporation)基因?qū)敕椒?2)基因槍法(Biolistic-bombardment)(植物細(xì)胞)TransferofT-DNAfromAgrobacteriuminto

aplantcell

RegenerationofleafdisksinfectedbyAgrobacteriumDNA重組外源基因插入與否可通過載體上的LacZ基因進(jìn)行初步的篩選。有外源基因插入的細(xì)菌呈白斑，無外源基因插入的細(xì)菌呈藍(lán)斑。Alfa互補(bǔ)藍(lán)-白顏色篩選(α互補(bǔ))一種巧妙的鑒定重組質(zhì)粒的方法：是藍(lán)-白顏色篩選。該法可以在同一轉(zhuǎn)化平板上完成篩選。這種方法涉及基因的插入失活：它利用一種藍(lán)色化合物的形成作為指示劑。在這種情況下失活基因是lacZ，該基因編碼β-半乳糖苷酶，受lac啟動子的調(diào)控。lacZ中間又插入了一段人工設(shè)計的DNA序列，稱為多克隆位點（MCS），含多個常用的限制性核酸內(nèi)切酶的位點，使外來的片段能很方便的被插入在此，當(dāng)外來序列插入后則破壞了lacZ編碼的半乳糖苷酶活性，生長的菌落就呈白色。即重組質(zhì)粒中l(wèi)acZ的插入失活將導(dǎo)致不能形成藍(lán)色菌落。該方法具體操作是將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布于含氨芐青霉素、IPTG和X-gal的平板上，形成有藍(lán)白兩色的菌落混合群體。X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，一種生色底物；

IPTG：異丙基--β-D-硫代半乳糖苷，一種誘導(dǎo)物白色菌落未表達(dá)β--半乳糖苷酶，因而可能含有插入的目的片段，而藍(lán)色菌落很可能是自環(huán)載體的克隆。當(dāng)E.coli菌株表達(dá)Lac阻抑物，則載體上的lacZ基因由IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)形成的酶可以利用底物X-gal形成一種藍(lán)色化合物。實際上這種方法中所用到的載體都是有一個lacZ截短后的衍生物是lacZ’，此基因編碼β--半乳糖苷酶的N端的α肽。這種載體須轉(zhuǎn)入一種含有表達(dá)β--半乳糖苷酶的C端部分的突變基因的宿主菌，使表達(dá)的β-半乳糖苷酶的C端能與α肽互補(bǔ)產(chǎn)生有活性的酶。這樣做的好處是縮短了質(zhì)粒所載基因的長度，但又沒有改變該法的原理。如pUC18攜帶細(xì)菌lacZ基因片段，可以編碼β-半乳糖苷酶N端146個氨基酸的肽段。這種α互補(bǔ)的原理也被用于某些噬菌體載體上，如

gt11。三、實驗儀器、材料與試劑儀器1.恒溫?fù)u床2.超凈工作臺3.恒溫水浴鍋4.恒溫箱5.微量取液器6.培養(yǎng)皿材料

1.實驗四所得的連接產(chǎn)物2.實驗五制備的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞

試劑LB固體培養(yǎng)基：每升LB培養(yǎng)基中加15g瓊脂。氨芐青霉素（Amp）：用無菌水配制成

50mg/mL溶液，0.22μm濾膜過濾除菌后，置-20℃冰箱保存。(300mg

6mLddH2O溶解，0.22μm濾膜過濾除菌)X-gal(20mg/mL):80mg4mL二甲基甲酰胺溶解，分裝，避光保存。ITPG(200mg/mL):300mg1.5mLddH2O溶解，

0.22μm濾膜過濾除菌。四、實驗步驟

取5-10μL連接產(chǎn)物加到200μL分裝的感受態(tài)細(xì)胞中。輕輕混勻，冰浴30min；42℃（水浴中）熱激90s，迅速在冰浴中冷3-5min；在上述管中加入600μLLB培養(yǎng)基，于37℃振蕩（慢搖）培養(yǎng)45min-1hr；制LB平板：將LB固體培養(yǎng)基溶化為液體，冷卻到50-60℃時，在150mL培養(yǎng)基中加氨芐青霉素（50mg/mL）150μL，使終濃度為50μg/mL。

pMD18-TVector