微生物代謝工程

代謝工程

MetabolicEngineering代謝代謝途徑是將一組特定的流入和流出代謝物質(zhì)聯(lián)系在一起的一個(gè)生化反應(yīng)序列。代謝流(物流/通量)(flux)指流入代謝物經(jīng)該途徑轉(zhuǎn)變?yōu)榱鞒鑫锏乃俾省Ｍǔ?，在一個(gè)特定的代謝途徑中存在有控制該途徑代謝流的關(guān)鍵位點(diǎn)，不同代謝途徑之間通過相關(guān)聯(lián)的節(jié)點(diǎn)連接在一起，從而在細(xì)胞內(nèi)形成了代謝網(wǎng)絡(luò)。代謝網(wǎng)絡(luò)可視為由若干個(gè)串聯(lián)或并聯(lián)的簡(jiǎn)單子途徑組成，它們通過節(jié)點(diǎn)相連。節(jié)點(diǎn)分為柔性、強(qiáng)剛性及弱剛性節(jié)點(diǎn)三類。所謂柔性節(jié)點(diǎn)，是指由節(jié)點(diǎn)流向各分支的代謝流量分割率隨代謝要求發(fā)生相應(yīng)的變化，去除產(chǎn)物的反饋抑制后，該分支的代謝流量分割率大大增加。所謂強(qiáng)剛性節(jié)點(diǎn)，是指由節(jié)點(diǎn)流向某一分支或某些分支的代謝流量分割率是難以改變的，這是由產(chǎn)物的反饋抑制及對(duì)另一分支酶的反式激活的相互作用所致。所謂弱剛性節(jié)點(diǎn)，是指介于前兩者之間，由該節(jié)點(diǎn)流向各分支的代謝流中有一個(gè)是占主導(dǎo)地位的，其酶活較高或?qū)?jié)點(diǎn)代謝的親和力較大，且無反饋抑制，通過削弱主導(dǎo)分支的酶量或酶活可增加產(chǎn)物的產(chǎn)率。C.glutamicumCCTCCM201005合成生物絮凝劑的代謝網(wǎng)絡(luò)模型

代謝物流分析(metabolicfluxanalysis)：一種計(jì)算流經(jīng)各種途徑的通量的技術(shù)，用于描述不同途徑的相互作用和圍繞支點(diǎn)的物流分布。代謝控制分析(metaboliccontrolanalysis):物流控制被分布在途徑的所有步驟中，只是若干步驟的物流比其他的更大些，可用數(shù)學(xué)方程來描述反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的控制機(jī)制，即用一途徑的物流和以物流控制系數(shù)來定量表示酶活之間的關(guān)系。物流控制系數(shù)(fluxcontrolcoefficient，F(xiàn)CC)是系統(tǒng)的性質(zhì)，大體上可用物流的百分比變化除以酶活(該酶能引起物流的改變)的百分比變化表示。

物流求和理論(fluxsummationtheory)是如果將一代謝系統(tǒng)中的某一物流的所有酶的物流控制系數(shù)加在一起，其和為1。物流分擔(dān)比(fluxsplitratio)是指途徑A與途徑B之比，如葡萄糖-6-磷酸節(jié)上的物流分擔(dān)比便是EMP途徑物流/(pp途徑物流)。

彈性系數(shù)(elascitycoefficients)表示酶催化反應(yīng)速率對(duì)代謝物濃度的敏感性。彈性系數(shù)是個(gè)別酶的特性。

在生物工程中通常是以生物細(xì)胞為反應(yīng)器，利用其固有的代謝網(wǎng)絡(luò)來合成所需的產(chǎn)物。由于遺傳背景的限制，細(xì)胞固有的代謝網(wǎng)絡(luò)常常很難滿足人類的需要，這就促使人們進(jìn)一步了解代謝網(wǎng)絡(luò)，并在此基礎(chǔ)上通過重組DNA技術(shù)來重新設(shè)計(jì)代謝途徑，調(diào)整代謝網(wǎng)絡(luò)，改造細(xì)胞原有特性以符合人類需要。代謝工程（metabolicengineering）途徑工程（Pathwayengineering）利用重組DNA技術(shù)來對(duì)生物細(xì)胞內(nèi)固有的代謝途徑進(jìn)行定向改造。(藉某些特定生化反應(yīng)的修飾來定向改善細(xì)胞的特性或運(yùn)用重組DNA技術(shù)來創(chuàng)造新的化合物。)

標(biāo)志著基因工程應(yīng)用已經(jīng)進(jìn)入到一個(gè)高級(jí)階段。代謝工程的要素：

將分析方法運(yùn)用于物流的定量化，用分子生物技術(shù)來控制物流以實(shí)現(xiàn)所需的遺傳改造。代謝工程要解決的主要問題－

改變某些途徑中的碳架物質(zhì)流量或改變碳架物質(zhì)流在不同途徑中的流量分布提高細(xì)胞現(xiàn)存代謝途徑中天然產(chǎn)物的產(chǎn)量；改造細(xì)胞現(xiàn)存代謝途徑，使其合成新產(chǎn)物，這種新產(chǎn)物可以是中間代謝產(chǎn)物或修飾型的最終產(chǎn)物對(duì)不同細(xì)胞的代謝途徑進(jìn)行擬合，構(gòu)建全新的代謝通路，從而產(chǎn)生細(xì)胞自身不能合成的新產(chǎn)物優(yōu)化細(xì)胞的生物學(xué)特性，如生長(zhǎng)速率、某些極端環(huán)境條件的耐受性代謝工程的本質(zhì)應(yīng)用重組DNA技術(shù)對(duì)細(xì)胞的酶反應(yīng)、物質(zhì)運(yùn)輸及調(diào)控功能進(jìn)行遺傳操作，從而改良細(xì)胞功能的技術(shù)。代謝工程涉及的主要內(nèi)容生物合成相關(guān)代謝調(diào)控和代謝網(wǎng)絡(luò)理論代謝流的定量分析代謝網(wǎng)絡(luò)的重新設(shè)計(jì)中心代謝作用機(jī)理及相關(guān)代謝分析；基因操作代謝工程的研究目的通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建具有能合成目標(biāo)產(chǎn)物的代謝網(wǎng)絡(luò)或具有高產(chǎn)能力的工程菌并用于生產(chǎn)。代謝工程所采用的概念來自反應(yīng)工程和用于生化反應(yīng)途徑分析的熱力學(xué)。它強(qiáng)調(diào)整體的代謝途徑而不是個(gè)別反應(yīng)。代謝工程涉及完整的生物反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)、途徑合成的問題、熱力學(xué)可行性、途徑的物流及其控制。要想提高某一方面的代謝和細(xì)胞功能應(yīng)從整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)的反應(yīng)而不是一個(gè)個(gè)反應(yīng)去考慮。重點(diǎn)應(yīng)放在途徑物流的放大和重新分配上。想通過單個(gè)酶的超表達(dá)來提高代謝途徑的物流是行不通的，除非此酶具有高的物流控制系數(shù)。假定能成功超表達(dá)途徑受限制的酶，該酶固然不再受反饋抑制，但瓶頸可能落在途徑下游的酶上，從而導(dǎo)致代謝中間體的大幅度的增加。同時(shí)和協(xié)調(diào)地超表達(dá)途徑中的大多數(shù)酶，原則上可大大提高代謝物流而不至于改變各代謝物的濃度。

另一種選擇是增加途徑產(chǎn)物的需求，這或許可通過提高產(chǎn)物的分泌速率辦到。代謝工程研究的設(shè)計(jì)思路提高通向目標(biāo)產(chǎn)物的代謝流擴(kuò)展代謝途徑構(gòu)建新的代謝途徑提高通向代謝產(chǎn)物的代謝流增強(qiáng)催化某反應(yīng)的酶的表達(dá)量或活性，從而提高代謝流；在有競(jìng)爭(zhēng)途徑（如分支代謝途徑）存在時(shí)，阻斷有害的或無關(guān)的競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑代謝產(chǎn)物的合成，從而達(dá)到改變代謝流，提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的目的。擴(kuò)展代謝途徑通過基因工程手段引入外源基因（簇）等，使原有代謝途徑進(jìn)一步向前或向后延伸，從而可利用新的原料用于合成目標(biāo)產(chǎn)物或產(chǎn)生新的末端代謝產(chǎn)物。構(gòu)建新的代謝途徑構(gòu)建新的代謝途徑一般指引入外源基因（簇）來改造和修飾代謝網(wǎng)絡(luò)，使細(xì)胞從不能合成某種代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)槟芎铣纱舜x產(chǎn)物。常用手段：（1）轉(zhuǎn)移代謝途徑，即將多個(gè)特定代謝途徑中的相關(guān)基因簇轉(zhuǎn)移到無這些基因的菌株中，從而達(dá)到使其能合成新的目標(biāo)產(chǎn)物的目的；（2）將無關(guān)的代謝途徑相連，形成新的代謝途徑，從而合成新的目標(biāo)產(chǎn)物。代謝工程研究的基本程序改良靶點(diǎn)的確定基因操作效果分析改良靶點(diǎn)的確定合理的改良靶點(diǎn)的確定通常是建立在代謝網(wǎng)絡(luò)的代謝流定量分析和控制分析的基礎(chǔ)上。選擇的靶點(diǎn)通常包括擬修飾的基因，擬導(dǎo)入代謝途徑和擬阻斷代謝途徑的靶點(diǎn)等?；虿僮饕坏┐_定了靶點(diǎn)之后，需考慮采用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)靶基因進(jìn)行遺傳操作。常見的操作類型有：基因簇的克隆、表達(dá)、修飾、敲除、整合等。遺傳操作是代謝工程研究的核心內(nèi)容。但應(yīng)注意掌握好對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行修飾的強(qiáng)度，只有適度的修飾才能獲得既不破壞細(xì)胞內(nèi)的精細(xì)平衡狀態(tài)，又能達(dá)到高產(chǎn)或合成新的目標(biāo)代謝產(chǎn)物的目的。效果分析對(duì)構(gòu)建的工程菌株的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行全面的效果分析是必要的。效果分析顯示出的問題往往又會(huì)成為新一輪實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)目標(biāo)。經(jīng)多輪遺傳操作后，往往可獲得優(yōu)良的可用于生產(chǎn)的工程菌株。代謝工程應(yīng)用研究進(jìn)展————在微生物