實(shí)驗(yàn)六-POD同工酶的提取分離活性測(cè)定定稿

Pleasebequiet,上課了?。⌒←溣酌邕^氧化物酶同工酶的提取、分離實(shí)驗(yàn)七學(xué)時(shí)：9馮麗、石峰1、掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理和方法；2、掌握同工酶的概念；3、掌握實(shí)驗(yàn)試劑的配制。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1、同工酶和電泳概念：2、影響電泳的主要因素：3、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）4、聚丙烯酰胺凝膠結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)：5、凝膠的質(zhì)量決定因素：6、不連續(xù)PAGE的原理：（1）三個(gè)不連續(xù)性的表現(xiàn)：(2)不連續(xù)系統(tǒng)中的三種物理效應(yīng)：

（3）

濃縮效應(yīng)產(chǎn)生的原因：

★

二、實(shí)驗(yàn)原理:

1、同工酶和電泳概念：（1）同工酶指催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其酶蛋白本身的分子結(jié)構(gòu)組成卻有所不同的一組酶。同工酶與生物的遺傳，生長(zhǎng)發(fā)育，代謝調(diào)節(jié)及抗性等都有一定的關(guān)系，如過氧化物酶在細(xì)胞代謝過程中與呼吸作用，光合作用，及生長(zhǎng)素的氧化等都有關(guān)系，測(cè)定POD活性或其同工酶，可以反映某一時(shí)期植物體內(nèi)代謝變化。（2）電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)中向與其自身所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象。二、實(shí)驗(yàn)原理:

由有效遷移率μ＝mα＝qα/6πrη，則可推出：（1）帶電顆粒的大小和形狀：顆粒越大，電泳速度越慢，反之越快；（2）顆粒的電荷數(shù)：電荷越少，電泳速度越慢，反之越快；（3）溶液的粘度：

粘度越大，電泳速度越慢，反之越快；（4）溶液的pH值：影響被分離物質(zhì)的解離度，離等電點(diǎn)越近，電泳速度越慢，反之越快；

2、影響電泳的主要因素：

（5）電場(chǎng)強(qiáng)度：電場(chǎng)強(qiáng)度越小，電泳速度越慢，反之越快；（6）離子強(qiáng)度：

離子強(qiáng)度越大，電泳速度越慢，反之越快；（7）電滲現(xiàn)象：

電場(chǎng)中，液體相對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)；（8）支持物篩孔大?。?/p>

孔徑小，電泳速度慢，反之則快。

聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯胺凝膠作為載體的一種區(qū)帶電泳。這種凝膠是由丙烯酰胺單體（Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基團(tuán)體系時(shí)，就會(huì)聚合。引發(fā)產(chǎn)生自由基的方法有兩種：（1）化學(xué)法（2）光聚合法。

3、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）

（1）化學(xué)聚合：

引發(fā)劑是過硫酸銨(AP)，催化劑N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED），它的堿基催化AP產(chǎn)生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺單體形成單體長(zhǎng)鏈?；瘜W(xué)聚合形成的凝膠孔徑較小，且重復(fù)性好，用來制備分離膠；（2）光聚合：光聚合法的催化劑是核黃素（VB2），光聚合形成的凝膠孔徑較大，且不穩(wěn)定，適于制備大孔徑的濃縮膠。

■

聚合反應(yīng)：架橋物造成分枝端點(diǎn)自由基可再延續(xù)freeradicalBisBis聚合反應(yīng)交錯(cuò)連結(jié)自由基形成（1）聚丙烯酰胺的基本結(jié)構(gòu)為丙烯酰胺單體構(gòu)成的長(zhǎng)鏈，鏈與鏈之間通過甲叉橋聯(lián)結(jié)在一起；（2）鏈的縱橫交錯(cuò)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使凝膠具有分子篩的性質(zhì)；（3）網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)還能限制蛋白質(zhì)等樣品的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，使凝膠具有抗對(duì)流的作用；（4）長(zhǎng)鏈富含酰胺基團(tuán)，使其成為穩(wěn)定的親水凝膠；（5）該結(jié)構(gòu)不帶電荷，在電場(chǎng)中電滲現(xiàn)象極為微小。

4、聚丙烯酰胺凝膠結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)：（1）凝膠度：是指100mg凝膠溶液中含有單體（Acr）和交聯(lián)劑（Bis）的總克數(shù)，用T%表示。（2）交聯(lián)度：

是指凝膠溶液中，交聯(lián)劑（Bis）占單體（Acr）和交聯(lián)劑（Bis）總量的百分?jǐn)?shù)，用C%表示。一般濃縮膠的濃度為7.5%，分離膠的濃度為10%。

5、凝膠的質(zhì)量決定因素：（1）三個(gè)不連續(xù)性的表現(xiàn)：①凝膠由上下兩層組成，兩層凝膠的孔徑不同；②緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同；③在電場(chǎng)中形成不連續(xù)的電位梯度。

6、不連續(xù)PAGE的原理：不連續(xù)PAGE電泳膠體系統(tǒng)的組成：1電泳系統(tǒng)pH膠體濃度緩沖液上層

(負(fù)極)緩沖液2

樣本溶液3濃縮膠

6.7

4分離膠5下層

(正極)緩沖液

Tris-HClTris-HClTris-glycine

Tris-HClTris-glycine

8.3

8.0

8.98.3

5%

7%

-

-

-

(2)不連續(xù)系統(tǒng)中的三種物理效應(yīng)：

①電荷效應(yīng)：酶蛋白按其所帶電荷的種類及數(shù)量，在電場(chǎng)作用下向一定的電極以一定的速度泳動(dòng)。

②分子篩效應(yīng):

相對(duì)分子質(zhì)量或構(gòu)型不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑的分離膠時(shí)，所受摩擦不同，受阻程度不同，表現(xiàn)出不同的遷移率。③濃縮效應(yīng):使待分離樣品中的各組分在濃縮膠中被壓縮成層。

★濃縮效應(yīng)產(chǎn)生的原因：（1）兩層膠的孔徑不同:酶蛋白向下移動(dòng)到兩層凝膠界面時(shí)，阻力突然加大，速度變慢。這樣，就在兩層凝膠交界處使待分離的酶蛋白區(qū)帶變窄，濃度升高。（2）濃縮膠中產(chǎn)生不連續(xù)的電位梯度:在聚丙烯酰胺凝膠中用的都是Tris-HCl緩沖液，但上層濃縮膠的pH為6.7，下層分離膠的pH為8.9。HCl為強(qiáng)電解質(zhì)，不管在哪層膠中幾乎全部電離，Cl布滿整個(gè)膠,待分離的酶蛋白加在點(diǎn)樣孔，浸在pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液中。電泳一開始，有效泳動(dòng)率最大的Cl迅速跑到最前面，成為快離子，在pH為6.7條件下解離度僅有0.1－1％的甘氨酸有效泳動(dòng)率最低，跑到最后面，成為慢離子，這樣在，快慢離子之間就形成一個(gè)不斷移動(dòng)的界面。在pH為6.7條件下帶有負(fù)電荷的酶蛋白，其有效泳動(dòng)率介于快慢離子之間，被夾持分布在界面附近，逐漸形成一個(gè)區(qū)帶。

■在濃縮膠中的三個(gè)主要作用角色：甘氨酸:pH=8.9負(fù)電荷pI=5.96不帶電荷Cl-1:蛋白質(zhì)(酶):小分子大分子■濃縮效應(yīng)：分離膠濃縮膠樣本8.96.7離子缺乏空間ABC++8.0V=I/S1、實(shí)驗(yàn)材料：小麥幼苗2、儀器、器皿：(1)垂直板電泳裝置（電泳槽，玻璃板，膠條，電泳梳子，制膠架等）；(2)穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀；（3）高速冷凍離心機(jī)；（4）電子天平；（5）電冰箱；（6）瓷盤、微量進(jìn)樣器；三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑：

3、試劑：

（1）1NHCl：用12N的濃鹽酸來配制；（2）分離膠緩沖液（pH8.9的Tris-HCl緩沖液）：（3）濃縮膠緩沖液（pH6.7Tris-HCl緩沖液）：（4）分離膠丙膠貯液（Acr-Bis貯液Ⅰ）：（5）濃縮膠丙膠貯液（Acr-Bis貯液Ⅱ）：（6）過硫酸銨溶液（NH4）2S2O8簡(jiǎn)寫Ap：（當(dāng)天配制）；（7）核黃素溶液：（8）電極緩沖液：（pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液）（9）40%蔗糖：

（10）pH4.7乙酸緩沖液：（11）樣品提取液：（12）0.5%的溴酚藍(lán)：0.5g溶于100ml無離子水；

（13）過氧化物酶同工酶聯(lián)苯胺染色液：1g聯(lián)苯胺加9ml冰醋酸，溶解后加36ml水用時(shí)加160ml水,加Vc140.8mg,加幾滴30%過氧化氫原液。聯(lián)苯胺是致癌物質(zhì)，稱取時(shí)應(yīng)戴手套；

1、貯液的配制：2、凝膠的制備：

2.1膠板的制備：2.2分離膠的制備：2.3濃縮膠的制備：3、酶液的制備：4、裝槽、點(diǎn)樣：5、電泳：6、剝膠、固定、染色：

四、實(shí)驗(yàn)步驟：

2.1膠板的制備：

2.2分離膠的制備：

按下表制備分離膠試劑名稱分離膠緩沖液分離膠丙膠貯液Ap無離子水體積比1241取用量（ml）36123

膠灌至距梳子齒下端1cm

→灌畢→封上一層水加速聚合→當(dāng)膠與水出現(xiàn)清晰界限時(shí)表明聚合好。

2.3濃縮膠的制備：

按下表制備濃縮膠

試劑名稱濃縮膠緩沖液濃縮膠丙膠貯液Ap蔗糖體積比1222取用量