酵母細(xì)胞的固定化-萬曉濤

專題4酶的研究及應(yīng)用課題3酵母細(xì)胞的固定化一、教學(xué)目標(biāo)（一）知識與技能1、識記固定化技術(shù)的常用方法2、理解固定化酵母細(xì)胞的制備過程3、知道固定化酶的實例（二）過程與方法1、固定化細(xì)胞技術(shù)2、制備固定化酵母細(xì)胞的過程（三）情感、態(tài)度與價值觀通過固定化技術(shù)的發(fā)展過程，培養(yǎng)科學(xué)探究精神，同時領(lǐng)會研究的科學(xué)方法二、課題重點與難點1．課題重點：制備固定化酵母細(xì)胞。2．課題難點：制備固定化酵母細(xì)胞。三、課題背景分析課題背景簡單介紹了從酶到固定化酶、再到固定化細(xì)胞的發(fā)展過程。這一過程體現(xiàn)了科學(xué)技術(shù)的發(fā)展是不斷地提出問題和解決問題的動態(tài)過程。在教學(xué)中，可以參考課題背景提供的素材，聯(lián)系生產(chǎn)實踐和學(xué)生已有的認(rèn)識，引導(dǎo)學(xué)生認(rèn)同上述觀點，并進(jìn)而認(rèn)識到：科學(xué)知識既來源于科學(xué)實驗，也來源于生產(chǎn)生活實踐，知識的學(xué)習(xí)應(yīng)該與生產(chǎn)實踐相聯(lián)系；人們在生產(chǎn)實踐中所發(fā)現(xiàn)的問題能夠促進(jìn)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展。在生物技術(shù)實踐活動中，經(jīng)常涉及技術(shù)原理和實踐意義等內(nèi)容，實驗教學(xué)中要重視這些認(rèn)知成分。自1969年世界上首次成功地將氨基?；腹潭ɑ糜诓鸱职被敢詠?，固定化酶和固定化細(xì)胞技術(shù)得到迅猛地發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于氨基酸的拆分和提純、葡萄糖和果糖的生產(chǎn)、診斷和分析試劑的制造、消除環(huán)境污染、特定的化學(xué)反應(yīng)等等。教學(xué)中，不僅應(yīng)遵循人類對固定化技術(shù)的研究歷程來逐步引導(dǎo)學(xué)生理解固定化技術(shù)的意義，而且要重視用典型實例（高果糖漿的生產(chǎn)）的剖析來引導(dǎo)學(xué)生認(rèn)識固定化技術(shù)的應(yīng)用價值。以下為人類對固定化技術(shù)的認(rèn)識歷程。四、基礎(chǔ)知識分析與教學(xué)【導(dǎo)學(xué)誘思】1?高果糖漿的生產(chǎn)需要使用 ，它能將葡萄糖轉(zhuǎn)化成果糖。這種酶的 好，可以持續(xù)發(fā)揮作用。但是，酶溶解于葡萄糖溶液后，就無法從糖漿中回收，造成很大的浪費。使用固定化酶技術(shù)，將這種酶固定在一種 上,再將這些酶顆粒裝到一個反應(yīng)柱內(nèi)，柱子底端裝上分布著許多小孔的 。酶顆粒無法通過篩板的小孔，而反應(yīng)溶液卻可以自由出入。生產(chǎn)過程中，將葡萄糖溶液從反應(yīng)柱的上端注入，使葡萄糖溶液流過反應(yīng)柱，與 接觸，轉(zhuǎn)化成果糖，從反應(yīng)柱的下端流出。反應(yīng)柱能連續(xù)使用半年,大大降低了生產(chǎn)成本，提高了果糖的產(chǎn)量和質(zhì)量。固定化酶和固定化細(xì)胞是利用 或 方法將酶或細(xì)胞固定在一定空間內(nèi)的技術(shù)，包括 、 和 法。一般來說，酶更適合采用 和 法固定，而細(xì)胞多采用 法固定化。這是因為細(xì)胞個大，而酶分子很小；個大的難以被 或 ，而個小的酶容易從 中漏出。包埋法法固定化細(xì)胞即將微生物細(xì)胞包埋在不溶于水的中。常用的載體有 、 、 、 和 等。

(一)教學(xué)方法：啟發(fā)式教學(xué)(二)教學(xué)工具：多媒體課件(三)教學(xué)過程：引入新課在應(yīng)用酶的過程中，人們發(fā)現(xiàn)了一些實際問題：酶通常對強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和有機(jī)溶劑等條件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很難回收，提高了生產(chǎn)成本，也可能影響產(chǎn)品質(zhì)量1、進(jìn)行新課1.1固定化酶的應(yīng)用實例一一生產(chǎn)高果糖漿學(xué)習(xí)內(nèi)容：1.利用固定化酶技術(shù)生產(chǎn)高果糖漿的實例；2.固定化酶的反應(yīng)柱示意圖；3.固定化酶在生產(chǎn)實踐中的優(yōu)點要點1從酶到固定化酶、再到固定化細(xì)胞的發(fā)展過程 廠優(yōu)點：催化效率高，低耗能、低污染，大規(guī)模地應(yīng)用于食品、化工等各個領(lǐng)域。酶一 I—實際問題：對環(huán)境條件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很難回收，不能被再次利用，提高了生產(chǎn)成本；反應(yīng)后酶會混合在產(chǎn)物中，如不除去，會影響產(chǎn)品質(zhì)量。 設(shè)想：將酶固定在不溶于水的載體上。 優(yōu)點：酶既能與反應(yīng)物接觸，又容易與產(chǎn)物分離，同時，固定在載體上的固定化酶一酶還可以反復(fù)利用。1—實際問題：一種酶只能催化一種化學(xué)反應(yīng)，而在生產(chǎn)實踐中，很多產(chǎn)物的形成都是通過一系列的酶促反應(yīng)才能得到的。 ?設(shè)想：酶是由細(xì)胞合成的，能否將合成酶的細(xì)胞直接固定。固定化細(xì)胞一優(yōu)點：成本低，操作更容易。要點2固定化酶的應(yīng)用實例高果糖漿的生產(chǎn)原理：葡萄糖~I葡萄糖異構(gòu)酶_m 果糖葡萄糖異構(gòu)酶固定：將葡萄糖異構(gòu)酶固定在顆粒狀載體上，裝入反應(yīng)柱中。高果糖漿的生產(chǎn)操作(識圖4－5反應(yīng)柱)：高果糖漿的生產(chǎn)需要使用葡萄糖異構(gòu)酶，它能將葡萄糖轉(zhuǎn)化成果糖。使用固定化酶技術(shù)，將這種酶固定在一種顆粒狀的載體上，再將這些酶顆粒裝到一個反應(yīng)柱內(nèi)。柱子底端裝上分布著許多小孔的篩板。酶顆粒無法通過篩板上的小孔，而反應(yīng)溶液卻可以自由出入。生產(chǎn)過程中，將葡萄糖溶液從反應(yīng)柱的上端注入，使葡萄糖溶液渡過反應(yīng)柱，與固定化葡萄糖異構(gòu)酶接觸，轉(zhuǎn)化成果糖，從反應(yīng)柱的下端流出。優(yōu)點：反應(yīng)柱能連續(xù)使用半年，大大降低了生產(chǎn)成本，提高了果糖的產(chǎn)量和質(zhì)量。固定化酶的反應(yīng)柱示意圖固定化酶在生產(chǎn)實踐中的優(yōu)點酶既能與反應(yīng)物接觸，又容易與產(chǎn)物分離，提高產(chǎn)品質(zhì)量；同時，固定在載體上的酶還可以反復(fù)利用，節(jié)約成本。1.2.固定化技術(shù)的方法(識圖4－6固定方法)：在本課題中，我們將動手制備固定化酵母細(xì)胞，體會固定化酶的作用。常用的固定化技術(shù)：包埋法、吸附法和結(jié)合法，教學(xué)時先讓學(xué)生討論哪些方法適于酶固定化？哪些方法適于細(xì)胞的固定化？將酶和細(xì)胞固定化方法有包埋法、化學(xué)結(jié)合法和物理吸附法。在討論的基礎(chǔ)上加以總結(jié)如下：常用方法操作缺陷酶包埋法酶分子一般相對較小，容易從大分子有機(jī)物網(wǎng)格中逸出；如果反應(yīng)物分子較大，則不易進(jìn)入網(wǎng)格中與酶接觸吸附法將酶吸附在不溶于水的載體上比較困難，同時酶也容易從載體上脫落結(jié)合法需要改變酶的某些結(jié)構(gòu)（基團(tuán)），酶的催化作用受到一定程度的影響細(xì)胞包埋法處于中心的細(xì)胞容易缺氧而受到損害，同時，反應(yīng)原料不易進(jìn)入到這些細(xì)胞之中比較】酶和細(xì)胞的固定方法和特點固定對象酶細(xì)胞適宜固定法化學(xué)結(jié)合法、物理吸附法包埋法特 點體積小，固定一種酶。包埋法容易丟失體積大，固定一系列酶。難以化學(xué)結(jié)合和吸附〖思考1〗對固定酶的作用影響較小的固定方法是什么？吸附法?！妓伎?〗將谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)谷氨酸的發(fā)酵過程變?yōu)檫B續(xù)的酶反應(yīng)，應(yīng)當(dāng)固定（酶、細(xì)胞）；若將蛋白質(zhì)變成氨基酸，應(yīng)當(dāng)固定（酶、細(xì)胞）。（二）固定化細(xì)胞技術(shù)學(xué)習(xí)內(nèi)容：1.將酶或細(xì)胞固定化的方法；2.固定化酶和固定化細(xì)胞的聯(lián)系與區(qū)別；3.固定化酶和固定化細(xì)胞常用的載體材料。教學(xué)：固定化酶和固定化細(xì)胞通常采用包埋法、化學(xué)結(jié)合法和物理吸附法。在教學(xué)過程中，可以通過提問的方式，引導(dǎo)學(xué)生認(rèn)識這三種方法的特點與適用范圍。此外，還可以引導(dǎo)學(xué)生思考課本中提出的問題，引導(dǎo)學(xué)生理解固定化細(xì)胞和固定化酶這兩種技術(shù)的區(qū)別與聯(lián)系，辯證地認(rèn)識這兩種技術(shù)的優(yōu)勢與不足。例如，固定化細(xì)胞操作容易、對酶活性的影響更小、可以催化一系列的反應(yīng)、容易回收等，但由于大分子物質(zhì)難以自由通過細(xì)胞膜，因此固定化細(xì)胞的應(yīng)用也受到限制。要點3固定化細(xì)胞技術(shù)（1）將酶或細(xì)胞固定化的方法固定化酶和固定化細(xì)胞是利用物理或化學(xué)方法將酶或細(xì)胞固定在一定空間內(nèi)的技術(shù)。酶或細(xì)胞固定化的方法包括包埋法、化學(xué)結(jié)合法（將酶分子或細(xì)胞相互結(jié)合，或?qū)⑵浣Y(jié)合到載體上）和物理吸附法。酶適合采用化學(xué)結(jié)合和物理吸附法固定化，而細(xì)胞多采用包埋法固定化。這是因為細(xì)胞個大，而酶分子很小；個大的細(xì)胞難以被吸附或結(jié)合，而個小的酶容易從包埋材料中漏出。酶的幾種固定方式將酶包埋在細(xì)微網(wǎng)格里；將酶相互連接起來；將酶吸附在載體表面。包埋法固定化細(xì)胞將微生物細(xì)胞均勻地包埋在不溶于水的多孔性載體中。（2） 固定化酶和固定化細(xì)胞的聯(lián)系與區(qū)別聯(lián)系：都是利用物理或化學(xué)方法將酶或細(xì)胞固定在一定空間內(nèi)的技術(shù)。在生產(chǎn)中都容易與產(chǎn)物分離，固定在載體上的酶或細(xì)胞可以反復(fù)利用。區(qū)別：適宜的固定方法不同；固定化細(xì)胞技術(shù)更適宜于生產(chǎn)實際。（3） 固定化細(xì)胞常用的載體材料常用的載體材料有明膠、瓊脂糖、海藻酸鈉、醋酸纖維素和聚丙烯酰胺等。1.3．固定細(xì)胞的材料：固定細(xì)胞時應(yīng)當(dāng)選用不溶于水的多孔性載體材料，如明膠、瓊脂糖、海藻酸鈉、醋酸纖維素和聚丙烯酰胺等教學(xué)：課程標(biāo)準(zhǔn)中要求學(xué)生嘗試制備和應(yīng)用固定化酶，但考慮到制作固定化酶的技術(shù)要求比較高，中學(xué)生難以掌握，因此只要求學(xué)生制作技術(shù)難度較低的固定化酵母細(xì)胞，對于固定化酶的作用、原理及其在生產(chǎn)中的應(yīng)用，主要是讓學(xué)生通過生產(chǎn)實例來了解。在教學(xué)時可以采用讓學(xué)生閱讀自學(xué)的方式，并在閱讀之前，布置一些思考題讓學(xué)生思考。例如，在葡萄糖的異構(gòu)反應(yīng)中，如果不將葡萄糖異構(gòu)酶固定化，而是直接使用葡萄糖異構(gòu)酶，會對生產(chǎn)過程產(chǎn)生哪些影響？2．實驗設(shè)計2.1．制備固定化酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞的活化：1g干酵母+10mL蒸餾水f50mL燒杯f攪拌均勻f放置lh,使之活化。加蒸餾水?dāng)嚢韪山湍?活化酵母〖思考3〗活化是指讓處于休眠狀態(tài)的微生物重新恢復(fù)正常生活狀態(tài)的過程。配制CaCl2溶液：配制物質(zhì)的量濃度為0.05mol/L的CaCl2溶液0.83gCaCl2+150mL蒸餾水f200mL燒杯f溶解備用。配制海藻酸鈉溶液：③配制海藻酸鈉溶液稱取0.7g海藻酸+10mL水f50mL燒杯f酒精燈微火(或間斷)加熱，并不斷攪拌，使之溶化f蒸餾水定容到10mL?！妓伎?〗微火加熱并不斷攪拌的目的是什么？防止海藻酸南焦糊。海藻酸鈉溶液與酵母細(xì)胞的混合：將海藻酸鈉溶液冷卻至室溫f加入活化酵母細(xì)胞f充分?jǐn)嚢鑖轉(zhuǎn)移至注射器中。〖思考5〗為什么要海藻酸鈉溶液冷卻后才能加入酵母細(xì)胞？防止高溫殺死酵母細(xì)胞。固定化酵母細(xì)胞：以恒定的速度緩慢地將注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，液滴在CaCl2溶液中形成凝膠珠，凝膠珠在CaCl2溶液中浸泡30min。2.2．固定化酵母細(xì)胞的發(fā)酵沖洗：將固定的酵母細(xì)胞凝膠珠用蒸餾水沖洗2?3次。發(fā)酵：150mL10%葡萄糖+固定化酵母細(xì)胞f200mL錘形瓶f密封f25°C發(fā)酵24h?！妓伎?〗發(fā)酵過程中錐形瓶為什么要密封？酵母菌的酒精發(fā)酵需要缺氧條件?！妓伎?〗錐形瓶中的氣泡和酒精是怎樣形成的？酵母菌進(jìn)行無氧呼吸產(chǎn)生的。〖思考8〗在利用固定化酶或固定化細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)的過程中，需要無菌操作碼？而令O2.3操作的注意事項本實驗是一個定量實驗，海藻酸鈉溶液的濃度和酵母細(xì)胞溶液混合后的溶液濃度是決定實驗成敗的關(guān)鍵因素，這有賴于實驗操作的各個環(huán)節(jié)嚴(yán)格按照要求進(jìn)行。在具體的操作過程中，還應(yīng)該注意下列問題。

.酵母細(xì)胞的活化。在缺水的狀態(tài)下，微生物會處于休眠狀態(tài)。活化就是讓處于休眠狀態(tài)的微生物重新恢復(fù)正常的生活狀態(tài)。酵母細(xì)胞所需要的活化時間較短，一般需要0.5?1h,需要提前做好準(zhǔn)備。此外，酵母細(xì)胞活化時體積會變大，因此活化前應(yīng)該選擇體積足夠大的容器，以避免酵母細(xì)胞的活化液溢出容器外。加熱使海藻酸鈉溶化是操作中最重要的一環(huán)，涉及到實驗的成敗，一定要提醒學(xué)生按照教材的提示進(jìn)行操作。海藻酸鈉的濃度涉及到固定化細(xì)胞的質(zhì)量。如果海藻酸鈉濃度過高，將很難形成凝膠珠；如果濃度過低，形成的凝膠珠所包埋的酵母細(xì)胞的數(shù)目少，影響實驗效果因為Ca2+與Na+交換需要一定時間，剛形成的凝膠珠應(yīng)在CaCl2溶液中浸泡一段時間，以便形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。只有形成穩(wěn)定的凝膠珠，才能在后續(xù)反應(yīng)中進(jìn)行利用。如何檢驗?zāi)z珠的質(zhì)量是否合格？方法一是用鑷子夾起一個凝膠珠放在實驗桌上用手?jǐn)D壓，如果凝膠珠不容易破裂，沒有液體流出，就表明凝膠珠的制作成功。方法二是在實驗桌上用力摔打凝膠珠，如果凝膠珠很容易彈起，也能表明制備的凝膠珠是成功的。教學(xué)時結(jié)合下圖分析可能存在的操作誤差。從下圖看，成功的凝膠珠如珍珠狀，色白而圓潤，而那些不規(guī)則的凝膠珠在CaCl溶液的位置通常是飄浮在溶液的上面或中間，這主要2是混合溶液的濃度過小或混入空氣而造成的。表為實驗步驟中的一些注意事項，可結(jié)合上圖進(jìn)行分析。實驗步驟注意事項酵母細(xì)胞的活化活化時應(yīng)用大一點的小燒杯，避免細(xì)胞溶液逸出，活化時間不易過長,20°C時只需1小時即可，該步驟由教師在課前完成配制CaCl溶液可實驗前配制好，放入冰箱中儲存2配制海藻酸鈉溶液小火間斷加熱，并不斷攪拌，直到完全融化，最后一定要定容海藻酸鈉溶液與酵母細(xì)胞混合待海藻酸鈉溶液冷卻至室溫時再混合，要充分?jǐn)嚢璨⒈苊獬霈F(xiàn)氣泡。轉(zhuǎn)移至注射器時，也要注意不要產(chǎn)生氣泡固定化酵母細(xì)胞注射器與CaCl溶液的距離應(yīng)保持在1米左右，混合溶液滴入燒杯時應(yīng)保2持勻速3．發(fā)酵操作4.課堂總結(jié)、點評五、實驗安排本課題可以安排2課時。第1課時完成課題背景和基礎(chǔ)知識的學(xué)習(xí)，準(zhǔn)備好基本的實驗儀器，同時還可以組織學(xué)生提前配制好CaCl2溶液和用于發(fā)酵的葡萄糖溶液。第2課時進(jìn)行酵母細(xì)胞的固定化操作。六、課題成果評價（一）觀察凝膠珠的顏色和形狀如果制作的凝膠珠顏色過淺、呈白色，說明海藻酸鈉的濃度偏低，固定的酵母細(xì)胞數(shù)目較少；如果形成的凝膠珠不是圓形或橢圓形，則說明海藻酸鈉的濃度偏高，制作失敗，需要再作嘗試。（二）觀察發(fā)酵的葡萄糖溶液利用固定的酵母細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)生酒精，可以看到產(chǎn)生了很多氣泡，同時會聞到酒味。不僅要對學(xué)生制作的固定化酵母細(xì)胞進(jìn)行評價，還要對學(xué)生的操作過程進(jìn)行評價。此外，對酵母細(xì)胞固定化原理和實驗操作方法的理解，也應(yīng)是評價的有機(jī)組成部分。★課余作業(yè)1．什么是細(xì)胞的活化。2．如何檢驗?zāi)z珠的質(zhì)量是否合格?！镔Y料袋固定化細(xì)胞的載體固定化細(xì)胞技術(shù)所采用載體的物理化學(xué)性質(zhì)直接影響所固定細(xì)胞的生物活性和體系傳質(zhì)性能。理想的載體材料應(yīng)具有對微生物無毒性、傳質(zhì)性能好、性質(zhì)穩(wěn)定。壽命長、價格低廉等特性。它可分為有機(jī)高分子載體、無機(jī)載體和復(fù)合載體三大類。有機(jī)高分子載體又分為天然高分子凝膠載體和合成有機(jī)高分子凝膠載體。天然高分子凝膠一般對生物無毒，傳質(zhì)