單核細(xì)胞增生李斯特氏菌MPN計(jì)數(shù)法課件

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Contents02延時(shí)符第五節(jié)

單核細(xì)胞增生李斯特菌檢驗(yàn)技術(shù)GB4789.30—2016

一、單核細(xì)胞增生李斯特菌生物學(xué)特性二、單核細(xì)胞增生李斯特菌定性檢驗(yàn)（第一法）三、單核細(xì)胞增生李斯特菌平板計(jì)數(shù)法（第二法）四、單核細(xì)胞增生李斯特菌MPN計(jì)數(shù)法（第三法）目錄02延時(shí)符第五節(jié)單核細(xì)胞增生李斯特菌檢驗(yàn)技術(shù)一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符概況單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes，LM）簡稱單增李斯特菌，歸屬李斯特氏菌菌屬，該屬含有6個(gè)菌種，分別為單核細(xì)胞增生李斯特菌(L.monocytogenes）、格氏李斯特菌(L.grayi)、斯氏李斯特菌(L.seeligeri)、威氏李斯特菌(L.welshimeri)、伊氏李斯特菌(L.ivanovii)、英諾克李斯特菌(L.innocua)。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes）和伊氏李斯特菌(L.ivanovii)（又稱綿羊李斯特菌）具有致病性，其余菌種均為非致病菌；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes）是李斯特菌屬的代表種，是李斯特氏菌屬中唯一能引起人類疾病的菌種。一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符概況一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符概況單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes）能引起新生兒敗血癥、腦膜炎、孕婦流產(chǎn)等疾病，具有較高的臨床死亡率(20%~70%)。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes）廣泛存在于自然界中，耐低溫，4℃的環(huán)境中能增殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes）主要污染乳及乳制品、肉類制品、生蔬菜、冰淇淋以及水產(chǎn)品等。一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符概況一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符菌體形態(tài)特征單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes）為規(guī)則短桿狀，兩端純圓，大小為0.4μm

~0.5μm

×0.5μm~2.0μm，多單生，偶有排列為V型或短鏈。

G+，無芽孢，一般不形成莢膜，但在營養(yǎng)豐富的生境中也可形成莢膜。20℃～25℃培養(yǎng)可產(chǎn)生4根周生鞭毛，有動(dòng)力，穿刺培養(yǎng)2-5天可見“倒傘狀”生長。肉湯培養(yǎng)物在顯微鏡下可見翻跟斗運(yùn)動(dòng)。一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符菌體形態(tài)特征一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符培養(yǎng)特征需氧或兼性厭氧，生長溫度范圍1℃～45℃，最適生長溫度30℃～37℃，4℃或以下溫度能緩慢增殖。對(duì)營養(yǎng)要求不高，在一般培養(yǎng)基上均能良好的生長，在血清或全血瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，加入0.2％～1％葡萄糖和2％～3％甘油更利于其生長。一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符培養(yǎng)特征一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符菌落特征普通營養(yǎng)瓊脂平板上為微帶珠光露水樣菌落，細(xì)小，半透明、邊緣整齊；45度斜射光下，菌落呈特征性藍(lán)綠光澤。血平板上培養(yǎng)的菌落呈灰白色、圓潤，?型溶血，溶血環(huán)直徑達(dá)3mm，4℃放置4d后,菌落和溶血環(huán)直徑均增至5mm，呈典型的奶油滴狀。一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符菌落特征一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符菌落特征液體培養(yǎng)基培養(yǎng)18h～24h后，呈輕度渾濁，數(shù)天后產(chǎn)生黏稠的沉淀，振蕩時(shí)呈螺旋狀上升，繼續(xù)培養(yǎng)可形成顆粒狀沉淀，不形成菌環(huán)、菌膜。半固體培養(yǎng)基中37℃、24h穿刺培養(yǎng)，沿穿刺線呈云霧狀，隨后緩慢擴(kuò)散，在培養(yǎng)基表面下3mm～5mm處呈傘狀。一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符菌落特征一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符生化特征單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes）37℃、24h培養(yǎng),可以分解葡萄糖、果糖、海藻糖、水楊苷、鼠李糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不分解棉子糖、肌醇、菊淀粉、衛(wèi)茅醇、側(cè)金盞花醇、木糖和甘露醇。MR和VP試驗(yàn)陽性，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，硫化氫陰性。

一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符生化特征一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符血清分型單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes）的血清型是由O抗原（菌體抗原）和H抗原（鞭毛抗原）的特異性組合決定，共有13種血清型：1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e和7。O抗原用阿拉伯?dāng)?shù)字表示，H抗原用英文字母表示。

一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符血清分型二、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)-GB4789.30-2016第一法

04延時(shí)符單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)程序流程圖適用于食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的定性檢驗(yàn)。二、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)-GB4789.30-2二、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)-GB4789.30-2016第一法

04延時(shí)符

增菌以無菌操作取樣品25g(mL)加入到含有225mLLB1

增菌液的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1min~2min；或放入盛有225mLLB1

增菌液的均質(zhì)杯中，以8,000r/min~10,000r/min均質(zhì)1min~2min。于30℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，移取0.1mL，轉(zhuǎn)種于10mLLB2

增菌液內(nèi)，于30℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。分離取LB2

二次增菌液劃線接種于李斯特氏菌顯色平板和PALCAM瓊脂平板，于36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h，觀察各個(gè)平板上生長的菌落。典型菌落在PALCAM瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷；在李斯特氏菌顯色平板上的菌落特征，參照產(chǎn)品說明進(jìn)行判定。二、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)-GB4789.30-2二、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)-GB4789.30-2016第一法

04延時(shí)符初篩自選擇性瓊脂平板上分別挑取3個(gè)~5個(gè)典型或可疑菌落，分別接種木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，同時(shí)在TSA-YE平板上劃線，于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h，然后選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定。二、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)-GB4789.30-2二、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)-GB4789.30-2016第一法

04延時(shí)符鑒定(或選擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)等)染色鏡檢動(dòng)力試驗(yàn)生化鑒定過氧化氫酶試驗(yàn)，過氧化氫酶陽性反應(yīng)的菌落繼續(xù)進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)和MR-VP試驗(yàn)。溶血試驗(yàn)協(xié)同溶血試驗(yàn)cAMP(可選項(xiàng)目)小鼠毒力試驗(yàn)(可選項(xiàng)目)二、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)-GB4789.30-2二、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)-GB4789.30-2016第一法04延時(shí)符結(jié)果與報(bào)告綜合以上生化試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)的結(jié)果，報(bào)告25g(mL)樣品中檢出或未檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。二、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)-GB4789.30-2三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB4789.30-2016第二法04延時(shí)符單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)程序流程圖適用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌含量較高的食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的計(jì)數(shù)。三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB4789.30-三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB4789.30-2016第二法

04延時(shí)符樣品的稀釋以無菌操作取樣品25g(mL)，放入盛有225mL緩沖蛋白胨水或無添加劑的LB肉湯的無菌均質(zhì)袋內(nèi)(或均質(zhì)杯)內(nèi)，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1min~2min或以8,000r/min~10,000r/min均質(zhì)1min~2min。液體樣品，振蕩混勻，制成1:10的樣品勻液。用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL緩沖蛋白胨水或無添加劑的LB肉湯的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面)，振搖試管，制成1:100的樣品勻液。依次制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB4789.30-三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB4789.30-2016第二法

04延時(shí)符樣品的接種根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè)~3個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液)，每個(gè)稀釋度的樣品勻液分別吸取1mL以0.3mL、0.3mL、0.4mL的接種量分別加入3塊李斯特氏菌顯色平板，用無菌L棒涂布整個(gè)平板，注意不要觸及平板邊緣。培養(yǎng)通常情況下，涂布后，將平板靜置10min；如樣液不易吸收，可將平板放在培養(yǎng)箱36℃±1℃培養(yǎng)1h，等樣品勻液被吸收后翻轉(zhuǎn)平皿，倒置于培養(yǎng)箱，36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h。三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB4789.30-三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB4789.30-2016第二法

04延時(shí)符確認(rèn)實(shí)驗(yàn)-初篩典型菌落確定：李斯特氏菌顯色平板上的菌落特征以產(chǎn)品說明為準(zhǔn)。典型菌落挑選：從典型菌落中任選5個(gè)菌落(小于5個(gè)全選)，分別初篩和鑒定。自選擇性瓊脂平板上分別挑取3個(gè)~5個(gè)典型或可疑菌落，分別接種木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，同時(shí)在TSA-YE平板上劃線，于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h，然后選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定。

確認(rèn)實(shí)驗(yàn)-鑒定

：染色鏡檢、動(dòng)力試驗(yàn)、生化鑒定、溶血試驗(yàn)、協(xié)同溶血試驗(yàn)cAMP(可選項(xiàng)目)三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB4789.30-三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB4789.30-2016第二法

04延時(shí)符典型菌落計(jì)數(shù)以及對(duì)應(yīng)的計(jì)算公式的應(yīng)用計(jì)數(shù)范圍要求：選擇有典型菌落的平板，菌落數(shù)合計(jì)在15CFU~150CFU之間的平板，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。計(jì)算公式1計(jì)算公式2.三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB4789.30-三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB4789.30-2016第二法

04延時(shí)符典型菌落計(jì)數(shù)以及對(duì)應(yīng)的計(jì)算公式的應(yīng)用計(jì)數(shù)范圍要求：選擇有典型菌落的平板，菌落數(shù)合計(jì)在15CFU~150CFU之間的平板，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。公式1適用情況①只有一個(gè)稀釋度的平板菌落數(shù)在15CFU~150CFU之間且有典型菌落，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落。②所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于15CFU且有典型菌落，應(yīng)計(jì)數(shù)最低稀釋度平板上的典型菌落。③某一稀釋度的平板菌落數(shù)大于150CFU且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落。④所有稀釋度的平板菌落數(shù)大于150CFU且有典型菌落，應(yīng)計(jì)數(shù)最高稀釋度平板上的典型菌落。⑤所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在15CFU~150CFU之間且有典型菌落，其中一部分小于15CFU或大于150CFU時(shí)，應(yīng)計(jì)數(shù)最接近15CFU或150CFU的稀釋度平板上的典型菌落。三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB4789.30-三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB4789.30-2016第二法

04延時(shí)符公式1應(yīng)用舉例:計(jì)算并報(bào)告下表檢測結(jié)果

樣品序號(hào)樣品勻液稀釋度菌落總數(shù)（平板1/平板2/平板3）典型菌落數(shù)（平板1/平板2/平板3）初篩做鑒定的典型菌落數(shù)鑒定為單核細(xì)胞增生李斯特菌的菌落數(shù)結(jié)果報(bào)告110-167（23/24/20）30（8/12/10）5410-212（3/5/4）1（0/1/0）11210-113（5/6/2）4（2/2/0）4310-28（2/3/3）2（0/1/1）22310-1194（68/60/66）65（18/26/21）5310-279（21/30/28）0（0/0/0）00410-1196（58/68/70）40（12/18/10）5210-2158（45/53/60）25（8/12/5）54510-1154（36/53/65）15（6/5/4）5310-29（2/3/4）3（0/1/2）32三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB4789.30-三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB4789.30-2016第二法

04延時(shí)符公式1應(yīng)用舉例

結(jié)果如下：根據(jù)計(jì)數(shù)公式的要求，對(duì)表內(nèi)數(shù)據(jù)與GB4789.30-2016的計(jì)數(shù)要求進(jìn)行比對(duì)分析，其中樣品序號(hào)1~5適用計(jì)算公式1，按照公式1進(jìn)行計(jì)算具體計(jì)算如下：樣品1：T=（8+12+10）×4÷5÷0.1=240；報(bào)240CFU/g(mL)或2.4×102CFU/g(mL)。樣品2：T=（2+2+0）×3÷4÷0.1＝30；報(bào)30CFU/g(mL)。樣品3：T=(18+26+21)×3÷5÷0.1=390;報(bào)390CFU/g(mL)或3.9×102CFU/g(mL)。樣品4：T=(8+12+5)×4÷5÷0.01=2000;報(bào)2,000CFU/g(mL)或2.0×103CFU/g(mL)。樣品5：T=(6+5+4)×3÷5÷0.1=90;報(bào)90CFU/g(mL)。注：①菌落數(shù)小于100CFU時(shí),按“四舍五入”原則修約,以整數(shù)報(bào)告；②菌落數(shù)大于或等于100CFU時(shí)，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù);也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字；③T＝0,則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。

三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB4789.30-三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB4789.30-2016第二法

04延時(shí)符典型菌落計(jì)數(shù)以及對(duì)應(yīng)的計(jì)算公式的應(yīng)用計(jì)數(shù)范圍要求：選擇有典型菌落的平板，菌落數(shù)合計(jì)在15CFU~150CFU之間的平板，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。公式2適用情況2個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在15CFU~150CFU之間且均有典型菌落。三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB4789.30-三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB4789.30-2016第二法

04延時(shí)符公式2應(yīng)用舉例：

:計(jì)算并報(bào)告下表檢測結(jié)果樣品序號(hào)樣品勻液稀釋度菌落總數(shù)（平板1/平板2/平板3）典型菌落數(shù)（平板1/平板2/平板3）初篩做鑒定的典型菌落數(shù)鑒定為單核細(xì)胞增生李斯特菌的菌落數(shù)結(jié)果報(bào)告110-1122（32/40/50）3（12/8/11）5210-270（28/41/1）16（6/9/1）53具體計(jì)算如下：T=[(12+8+11)×2÷5]×[(6+9+1)×3÷5]÷1.1÷0.1=733.09;報(bào)730CFU/g(mL)或7.3×102CFU/g(mL)。注：①菌落數(shù)小于100CFU時(shí),按“四舍五入”原則修約,以整數(shù)報(bào)告；②菌落數(shù)大于或等于100CFU時(shí)，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù);也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字；③T＝0,則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。

三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB4789.30-三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB4789.30-2016第二法04延時(shí)符結(jié)果與報(bào)告根據(jù)計(jì)算結(jié)果，報(bào)告每g(mL)樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌數(shù)，以CFU/g(mL)表示；如T值為0，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB4789.30-四、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌MPN計(jì)數(shù)法-GB4789.30-2016第三法04延時(shí)符適用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌含量較低(<100CFU/g)而雜菌含量較高的食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的計(jì)數(shù)，特別是牛奶、水以及含干擾菌落計(jì)數(shù)的顆粒物質(zhì)的食品。四、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌MPN計(jì)數(shù)法-GB4789.3四、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌MPN計(jì)數(shù)法-GB4789.30-2016第三法04延時(shí)符樣品的稀釋以無菌操作稱取樣品25g(mL)，放入盛有225mL緩沖蛋白胨水或無添加劑的LB肉湯的無菌均質(zhì)袋內(nèi)(或均質(zhì)杯)內(nèi)，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1min~2min或以8,000r/min~10,000r/min均質(zhì)1min~2min。液體樣品，振蕩混勻，制成1:10的樣品勻液。用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL緩沖蛋白胨水或無添加劑的LB肉湯的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面)，振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。依次制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。四、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌MPN計(jì)數(shù)法-GB4789.30四、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌MPN計(jì)數(shù)法-GB4789.30-2016第三法04延時(shí)符接種和培養(yǎng)根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選取3個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液)，接種于10mLLB1肉湯，每一稀釋度接種3管，每管接種1mL(如果接種量需要超過1mL，則用雙料LB1增菌液)于30℃±1℃培養(yǎng)24h±