信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的核酸分子基礎(chǔ)

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的核酸分子基礎(chǔ)1.堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤鳥嘌呤尿嘧啶胸腺嘧啶胞嘧啶存在于DNA和RNA中僅存在于RNA中僅存在于DNA中一、核酸的組成與結(jié)構(gòu)

(一）核苷酸嘌呤(purine，Pu)腺嘌呤(adenine,A)鳥嘌呤(guanine,G)嘧啶(pyrimidine，Py)胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶(thymine,T)稀有堿基2.核糖、核脫氧核糖（構(gòu)成RNA）1′2′3′4′5′核糖(ribose)（構(gòu)成DNA）脫氧核糖(deoxyribose)3.核苷嘌呤N-9

或嘧啶N-1與脫氧核糖C-1

通過β-N-糖苷鍵相連形成脫氧核苷(deoxyribonucleoside)。

嘌呤N-9或嘧啶N-1與核糖C-1

通過β-N-糖苷鍵相連形成核苷(ribonucleoside)。NNNN9NH2OOHOHHHHCH2OHH1'2'糖苷鍵核苷或脫氧核苷與磷酸通過酯鍵結(jié)合構(gòu)成核苷酸(ribonucleotide)或脫氧核苷酸(deoxyribonucleotide)。4.核苷酸(ribonucleotide)NNNN9NH2OOHOHHHHCH2H1'2'OPO-HOO糖苷鍵酯鍵多磷酸核苷酸cAMP★（二）環(huán)化核苷酸cGMP5′-末端3′-末端CGA磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵（三）DNA的分子結(jié)構(gòu)Watson-Crick模型Watson，JamesDewey（詹姆斯·沃森；1928～)弗朗西斯·哈里·康普頓·克里克

（FrancisHarryComptonCrick1916.6.8—2004.7.28）

*Chargaff規(guī)則研究背景獲得了高質(zhì)量的DNA分子的X射線衍射照片。提出了DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)(doublehelix)模型。a.富蘭克林b.DNA的X線衍射圖片堿基互補配對三鏈結(jié)構(gòu)鳥嘌呤之間通過Hoogsteen氫鍵形成特殊的四鏈結(jié)構(gòu)(tetraplex)。四鏈結(jié)構(gòu)原核生物DNA多為環(huán)狀，以負超螺旋的形式存在，平均每200堿基就有一個超螺旋形成。核小體串珠樣的結(jié)構(gòu)核小體鏈和螺旋管雙鏈DNA的折疊和組裝1.基因組DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成染色體，存于細胞核，（除配子細胞外，體細胞內(nèi)的基因組是雙份的，即雙倍體,diploid）有兩份同源的基因組。真核生物DNA特點2.基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子；即一個結(jié)構(gòu)基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯生成一個mRNA分子和一條多肽鏈。3.存在重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)可達百萬次以上；4.基因組中不編碼的區(qū)域多于編碼區(qū)域；5.大部分基因含有內(nèi)含子，基因是不連續(xù)的；6.基因組遠大于原核生物的基因組，有許多復(fù)制起點

（四）RNA的結(jié)構(gòu)（1）tRNA（2）mRNAhnRNA內(nèi)含子(intron)mRNA

外顯子(exon)（3）rRNA二、核酸的理化性質(zhì)、提取1.紫外吸收（一）理化性質(zhì)260nm（1）樣品DNA或RNA的定量A260=1.0相當于50μg/ml雙鏈DNA(dsDNA)40μg/ml單鏈DNA(ssDNAorRNA)20μg/ml寡核苷酸（2）確定樣品中核酸的純度

純

DNA:A260/A280=1.8

純

RNA:A260/A280=2.0

核酸提取樣品：A260/A280=1.8~2.0比值大的純度不一定高，還可能是提取過程中有酚等其他有機物的干擾?！镒贤馕盏膽?yīng)用2.核酸的變性、復(fù)性和雜交※解鏈溫度(meltingtemperature，Tm)G+C含量越高，解鏈溫度就越高。退火(annealing)與雜交DNA雜交的退火溫度≈Tm-25℃★（二）核酸的提取、分離和純化1.DNA的提取分離（1）苯酚法（常用）

苯酚作為蛋白變性劑,同時抑制了DNase的降解作用。

可用玻璃慢慢繞成一團，取出。此法的特點：DNA保持天然狀態(tài).(2)CTAB法加苯酚有效的去除蛋白質(zhì)，但是苯酚的氧化物對DNA有破壞作用，用過苯酚之后再用氯仿異戊醇抽提一次以除去殘余的苯酚。(3)三氯甲烷法1.三氯甲烷-戊醇除蛋白（中間層）2.水相提取DNA3.三氯甲烷-戊醇再除蛋白4.水相再提取DNA（至無蛋白凝膠）(4)酶法蛋白酶除蛋白核酸酶除RNA提純DNA（1）Trizol法（異硫氰酸胍苯酚混合液相提取法）

異硫氰酸胍裂解細胞→核蛋白體分離→RNA釋放到水相2.RNA的提取分離（2）硅膠膜特異性吸附離心柱提取法

異硫氰酸胍裂解細胞→抑制RNA酶→RNA釋放→硅膠特異性吸附RNA→除去蛋白質(zhì)和DNA→低鹽洗脫RNARNA分布三、核酸含量測定的原理（一）定磷法P：9.4%~9.6%（二）定糖法1.核糖2.脫氧核糖（三）紫外吸收法（四）環(huán)核苷酸的檢測1.競爭性蛋白結(jié)合法測cAMP（125I－cAMP放免