瓜馥木化學(xué)成分

瓜馥木化學(xué)成分

1儀器與材料

顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀；AB-HS型質(zhì)譜儀；DRX-400型超導(dǎo)核磁共振儀，TMS為內(nèi)標(biāo)。3164型二氧化碳培養(yǎng)箱；比色采用ThermoLabsystemsMultiskanMK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀。

藥材采于江西，由江西中醫(yī)學(xué)院賴學(xué)文副教授鑒定為瓜馥木FissistigmaoldhamiiMerr.，標(biāo)本存于廣東醫(yī)學(xué)院藥學(xué)教研室。

2方法與結(jié)果

提取與分離瓜馥木根藥材經(jīng)粉碎后用乙醇加熱回流提取，合并濾液，減壓濃縮得總浸膏590g。浸膏用5%HCl捏溶處理后其酸不溶性部分用蒸餾水洗至中性，用水分散均勻，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯進(jìn)行提取，回收溶劑得石油醚部分，氯仿部分63g，醋酸乙酯部分。氯仿部分反復(fù)進(jìn)行硅膠柱色譜，以三氯甲烷-甲醇為洗脫劑，得馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ化合物。

結(jié)構(gòu)鑒定采用化學(xué)和光譜的方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。該化合物與生物堿試劑反應(yīng)呈陽性，推測(cè)該化合物為生物堿。EI-MS給出分子離子m/z265，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR，推斷分子式為C16H11NO3。UVλMeOHmaxnm:230,265,277；IRKBrmaxcm-1：3450，3251，1691，1656，1614，1502；EI-MS譜：265，250，222，UV，IR，EI-MS的特征顯示該化合物屬于馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分［3］。1H-NMR顯示在δ為一甲氧基信號(hào)；δ～處有6個(gè)芳香質(zhì)子信號(hào)，其中δ，，顯示出未取代的D環(huán)有4氫，H-5由于受3個(gè)環(huán)的去屏蔽作用，出現(xiàn)在最低場(chǎng)的δ處，可知δ為H-6,H-7，δ為H-8；δ及二個(gè)孤立芳香質(zhì)子信號(hào)顯示A、C環(huán)上各有一孤立芳香質(zhì)子，因此，A環(huán)中有兩個(gè)芳香質(zhì)子被取代。13C-NMR顯示在δ處為內(nèi)酰胺羰基信號(hào),在δ～有14個(gè)芳碳信號(hào)，DEPT顯示有9個(gè)季碳、6個(gè)叔碳信號(hào)，δ處為甲氧基。該化合物的UV，IR，1H-NMR，13C-NMR，EI-MS數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［3，4］中的馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ數(shù)據(jù)基本一致。因此，該化合物被鑒定為AristolactamAII，結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1瓜馥木中各化合物結(jié)構(gòu)式

樣品體外培養(yǎng)抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為①空白組：每孔僅為1640培養(yǎng)液，在測(cè)光密度值時(shí)用于調(diào)“0”；②對(duì)照組：每孔為含1640培養(yǎng)液稀釋的單細(xì)胞懸液；③實(shí)驗(yàn)組：又分×103，×102，，，，×10-2μmol·L-1馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ組，即每孔含1640培養(yǎng)液稀釋的單細(xì)胞懸液和不同濃度馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ。精密稱量馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ后用少量DMSO充分溶解，再用1640培養(yǎng)基稀釋成不同濃度備用。各組每孔溶液總體積均為μl。

法檢測(cè)藥物的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)取已貼壁的GLC-82細(xì)胞，用質(zhì)量濃度為%胰酶消化后，計(jì)數(shù)活細(xì)胞，用1640培養(yǎng)基稀釋成5×104/ml的單細(xì)胞懸液備用；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的懸浮HL60細(xì)胞用1640培養(yǎng)基稀釋成1×105/ml的單細(xì)胞懸液備用。分別將兩種單細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組每孔加單細(xì)胞懸液μl，不同濃度實(shí)驗(yàn)組每孔加單細(xì)胞懸液μl和不同濃度的馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡμl；對(duì)照組和不同濃度實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞接種后置于37℃，100％相對(duì)濕度，含5％CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)48h；然后取出，仔細(xì)地吸去上清液，于每孔中加入μlDMSO，輕輕振蕩以使甲臜完全溶解；約1h后于490nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)OD值。按抑制率=×100%計(jì)算。采用統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間樣本均數(shù)采用Dunnett-t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及分析結(jié)果見表1。并用Probit回歸法［5］估算半數(shù)抑制濃度，馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ?qū)LC-82，HL60細(xì)胞的IC50分別為，μmol·L-1。

表1馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ?qū)LC-82及HL60細(xì)胞抑制的影響

與對(duì)照組比較，*P<，**P<；n=4

3討論

本研究用MTT法研究發(fā)現(xiàn)：從瓜馥木中分離得到的單體化合物馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ堿對(duì)GLC-82細(xì)胞和HL60細(xì)胞均表現(xiàn)出一定的腫瘤抑制作用，且抑制作用隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)，作用強(qiáng)度與劑量呈一定的量效關(guān)系。

在低劑量1μmol·L-1以下時(shí)，馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ?qū)Ψ蜗侔〨LC-82細(xì)胞株的作用不明顯，但對(duì)于白血病HL60細(xì)胞株抑制作用在劑量μmol·L-1以上時(shí)作用明顯。通過回歸計(jì)算的IC50分別為，μmol·L-1，其作用效果不同，表明馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ?qū)煞N細(xì)胞株有一定的選擇作用，作用機(jī)制尚須進(jìn)一步研究。

從瓜馥木中分離得到的O-甲基芒籽堿、氧代克斑寧等化合物對(duì)肺腺癌GLC-82細(xì)胞株亦有抗癌活性且作用強(qiáng)度相似［5］，但馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ的IC50為μmol·L-1，其作用強(qiáng)度不同，可能與化合物的結(jié)構(gòu)類型有關(guān)?；衔颫-甲基芒籽堿、氧代克斑寧為阿樸菲類型生物堿，馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ?yàn)轳R兜鈴內(nèi)酰胺類型生物堿，研究表明針對(duì)肺腺癌GLC-82細(xì)胞株，化合物的結(jié)構(gòu)母核起主導(dǎo)作用，各取代基團(tuán)對(duì)它的生物活性有一定的影響。初步構(gòu)效關(guān)系研究表明，