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外源基因的原核表達10/8/20231外源基因表達的作用:外源基因表達泛指目的基因與表達載體重組后,導(dǎo)入合適的受體細胞,并能在其中有效表達,產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物。外源基因的表達是研究和探索基因功能、基因表達調(diào)控機制、編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的重要方法,也是制備和生產(chǎn)新型蛋白質(zhì)藥物、診斷試劑必不可少的手段。通過外源基因的表達可由宿主細胞產(chǎn)生大量的目的蛋白。10/8/20232常用的原核外源表達系統(tǒng)大腸桿菌表達系統(tǒng)芽孢桿菌表達系統(tǒng)鏈霉菌表達系統(tǒng)藍藻表達系統(tǒng)10/8/20233原核生物基因表達系統(tǒng)的特點:1、原核生物大多數(shù)為單細胞異養(yǎng),生長快,代謝易于控制,可通過發(fā)酵迅速獲得大量基因表達產(chǎn)物。2、基因組結(jié)構(gòu)簡單,便于基因操作和分析。3、多數(shù)原核生物細胞內(nèi)含有質(zhì)粒或噬菌體,便于構(gòu)建相應(yīng)的表達載體。10/8/20234原核生物基因表達系統(tǒng)的特點:4、不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng),表達產(chǎn)物無特定的空間構(gòu)象。5、內(nèi)源蛋白酶會降解表達的外源蛋白,造成表達產(chǎn)物的不穩(wěn)定。由于以上特點,近年來真核生物表達系統(tǒng)發(fā)展很快,并構(gòu)建了相應(yīng)的基因表達載體。10/8/20235大腸桿菌表達系統(tǒng)大腸桿菌表達系統(tǒng)是基因表達技術(shù)中發(fā)展最早,目前應(yīng)用最為廣泛的經(jīng)典表達系統(tǒng)。屬革蘭氏陰性細菌。其特點是:遺傳背景清楚目的基因表達水平高培養(yǎng)時間短10/8/20236大腸桿菌表達系統(tǒng)的主要不足1、缺少真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后修飾和加工過程。2、表達的蛋白質(zhì)多以包含體形式存在,需經(jīng)復(fù)性才能恢復(fù)構(gòu)象與活性3、宿主本身雜蛋白質(zhì)多,純化步驟復(fù)雜。10/8/20237大腸桿菌基因表達載體理想的大腸桿菌表達載體的特征1、穩(wěn)定的遺傳和復(fù)制能力,在無選擇壓力下保存于大腸桿菌細胞內(nèi)2、具有顯性的轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記3、轉(zhuǎn)錄可以調(diào)控,抑制時本底轉(zhuǎn)錄水平較低4、轉(zhuǎn)錄的mRNA能夠在適當(dāng)?shù)奈恢媒K止且轉(zhuǎn)錄不影響載體的復(fù)制5、具備適用于外源基因插入酶切位點10/8/20238大腸桿菌基因表達載體構(gòu)成1、復(fù)制子:是一段包含起始位點和反式因子作用區(qū)在內(nèi)的DNA片段。其功能是通過復(fù)制使載體穩(wěn)定存在于大腸桿菌細胞。10/8/20239大腸桿菌基因表達載體2、篩選標(biāo)記:大腸桿菌經(jīng)過轉(zhuǎn)化后,僅有少數(shù)細菌能獲得攜帶外源基因的質(zhì)粒并穩(wěn)定地傳代,篩選標(biāo)記可有效地篩選出轉(zhuǎn)化有外源基因的陽性重組。10/8/202310大腸桿菌基因表達載體3、啟動子:是與DNA依賴的RNA聚合酶相結(jié)合的一段DNA序列。啟動子是調(diào)控外源基因轉(zhuǎn)錄的重要順式作用元件,與mRNA的合成有很大關(guān)系,是表達載體不可缺少的元件。10/8/202311大腸桿菌基因表達載體4、終止子:在轉(zhuǎn)錄過程中能在特異位點將轉(zhuǎn)錄終止的DNA序列。有兩種類型1、ρ-因子型終止子2、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)10/8/20231210/8/202313大腸桿菌基因表達載體4、終止子:能在特異位點終止轉(zhuǎn)錄的DNA序列。終止子有兩種類型1、ρ-因子2、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)10/8/20231410/8/20231510/8/202316終止子的功能(1)、能能有效控制目的基因mRNA的長度(2)、提高mRNA的穩(wěn)定性(3)、避免載體上其他基因的異常表達10/8/202317大腸桿菌基因表達載體5、核糖體結(jié)合位點:原核細胞mRNA蛋白合成起始點上游的一段非編碼序列。能與30S小亞基中16SrRNA3’末端的一段序列特異結(jié)合。此序列富含嘌呤,核心序列為SD序列。10/8/202318大腸桿菌基因表達載體6、密碼子:密碼子有簡并性,多個密碼子為一個氨基酸進行編碼,不同生物在利用這些密碼子時其利用頻率不同,不同的密碼子會影響到大腸桿菌的翻譯速度。10/8/202319基因表達的機制基因工程技術(shù)的核心是基因表達技術(shù)。迄今為止,已構(gòu)件建了不同類型的表達系統(tǒng),可根據(jù)需要合理地選擇適當(dāng)?shù)谋磉_系統(tǒng)。外源基因在受體細胞中的表達包括:1、轉(zhuǎn)錄2、翻譯兩個環(huán)節(jié)10/8/202320基因表達的機制基因工程的核心問題:有效表達外源基因表達的關(guān)鍵步驟:起始轉(zhuǎn)錄基因表達的限速步驟:轉(zhuǎn)錄起始的速率構(gòu)建表達系統(tǒng)時首先要考慮的問題是:1、選擇可調(diào)控的啟動子2、相關(guān)的調(diào)控序列10/8/202321目的:在細胞生長的初期不表達或低水平表達,當(dāng)細胞增殖到一定的密度時,在某種特定的誘導(dǎo)因子的誘導(dǎo)下啟動轉(zhuǎn)錄合成mRNA。啟動子原核生物啟動子真核生物啟動子誘導(dǎo)型誘導(dǎo)型組成型組成型10/8/202322mRNA的延伸與穩(wěn)定性:有效表達的關(guān)鍵是:保持mRNA的1、有效延伸2、正確終止3、mRNA在細胞中的穩(wěn)定存在10/8/202323mRNA的有效延伸:導(dǎo)致mRNA轉(zhuǎn)錄提前終止的可能原因有和解決辦法1、衰減子:類似于簡單的終止子,在原核生物中一般位于操縱子的啟動子與第一個結(jié)構(gòu)基因之間。在構(gòu)建表達載體時應(yīng)避免該序列的存在。10/8/2023242、非特異終止:防止非特異性終止的方法是在構(gòu)建表達載體時加入抗終止的序列元件。10/8/202325轉(zhuǎn)錄的正確終止也是外源基因有效表達的重要因素,可以防止產(chǎn)生不必要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,使mRNA的長度限制在一定的范圍內(nèi),從而增加外源基因表達的穩(wěn)定性。原核生物解決辦法真核生物解決辦法10/8/202326mRNA在細胞中的穩(wěn)定存在:mRNA在受體細胞中的穩(wěn)定存在直接決定翻譯產(chǎn)物的多少。解決辦法1、原核生物:選擇一個RNase缺失的工程菌株。2、真核生物:提高mRNA的正確加工10/8/202327外源基因mRNA的有效翻譯為使外源基因有效翻譯,在構(gòu)建表達體系時應(yīng)考慮以下問題:1、AUG為首選起始密碼子2、SD序列為與核糖體結(jié)合位點3、SD序列與起始密碼子之間的距離為3~9個堿基4、在翻譯起始區(qū)周圍的序列不易形成明顯的二級結(jié)構(gòu)5、選擇合適的終止密碼子10/8/202328表達蛋白在細胞中的穩(wěn)定性常用的措施有:1、構(gòu)建融合蛋白表達系統(tǒng)2、構(gòu)建分泌蛋白表達系統(tǒng)3、構(gòu)建包涵體表達系統(tǒng)4、選擇蛋白水解酶基因缺陷受體系統(tǒng)10/8/202329外源基因在大腸桿菌中表達產(chǎn)物在細胞的位置:外源基因在大腸桿菌中的表達產(chǎn)物可能存在于細胞質(zhì)、細胞周質(zhì)和細胞外培養(yǎng)基中。其表達形式包括形成:1、不溶性蛋白2、可溶性蛋白10/8/202330大腸桿菌載體的表達方式非融合表達載體融合表達載體帶純化標(biāo)簽表達載體分泌型表達載體表面展示表達載體帶分子伴侶表達載體10/8/2023311、非融合表達載體:應(yīng)用此種載體表達的蛋白質(zhì)與天然狀態(tài)下存在的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)、功能和免疫原性等方面基本或完全一致。目前上市的細胞因子類產(chǎn)品多采用此類表達載體。2、融合表達載體:分子量較小的蛋白質(zhì)常用此類載體進行表達。將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起,但不改變兩個基因閱讀框。10/8/202332在進行融合表達時,一般將受體菌蛋白位于N端,而外源蛋白位于C端。外源蛋白與菌體自身蛋白以融合蛋白的方式表達后其穩(wěn)定性大大增加。其原因為:外源小分子蛋白上的酶切位點暴露于分子的表面。當(dāng)以融合蛋白的形式表達后,外源蛋白部分在菌體自身蛋白的引導(dǎo)下正確折疊,可最大程度上封閉酶切位點。10/8/202333帶純化標(biāo)簽的表達載體:載體上具有一段特殊序列,該序列表達后可作為純化標(biāo)簽。目的基因與該序列融合表達后,用親和層析的方法很方便的將目的蛋白分離,切除標(biāo)簽序列后可得到純化的目的蛋白。10/8/202334分泌型表達載體:將目的基因與信號肽融合表達,表達蛋白在信號肽的引導(dǎo)下成為分泌蛋白。表面展示載體:將目的基因克隆到細菌表面蛋白的結(jié)構(gòu)基因中,從而達到細菌表面表達。帶分子伴侶的表達載體:10/8/20233510/8/20233610/8/20233710/8/202338宿主菌大腸桿菌表達系統(tǒng)表達的基因一般都是異源基因,甚至是真核生物基因,而在細胞內(nèi)積累大量的異源蛋白極易被降解。造成重組異源蛋白在大腸桿菌中不穩(wěn)定的原因有:1、大腸桿菌缺乏復(fù)雜的翻譯后加工和蛋白質(zhì)折疊系統(tǒng);10/8/2023392、大腸桿菌不具備類似真核細胞的亞細胞結(jié)構(gòu)和表達產(chǎn)物穩(wěn)定因子;3、大量的異源重組蛋白在大腸桿菌細胞中形成高濃度微環(huán)境,導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子之間的作用增強。由于以上原因,為使外源基因高效表達,必須構(gòu)建作為基因表達受體菌的工程菌株。10/8/202340常見的大腸桿菌表達系統(tǒng)Lac和Tac表達系統(tǒng):以lac操縱子調(diào)控機制為基礎(chǔ)設(shè)計和構(gòu)建的表達系統(tǒng)。通過對大腸桿菌tacI基因誘變,獲得能過量表達lacI
阻遏蛋白的基因突變體lacIq,使外源基因的表達調(diào)控在一定的水平。此外,目前還構(gòu)建了阻遏蛋白溫度敏感型突變體lacIq(ts)宿主菌和載體,使lac和tac啟動子的轉(zhuǎn)錄受溫度的控制,在低溫(30oC)下基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制,在(42oC)下基因的轉(zhuǎn)錄保持開放。10/8/202341常見的大腸桿菌表達系統(tǒng)PL和PR啟動子表達系統(tǒng):以λ噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動子PL和PR構(gòu)建的。在野生型λ噬菌體中,PL和PR啟動子的轉(zhuǎn)錄與否決定λ噬菌體進入裂解循環(huán)或溶原循環(huán)。λ噬菌體PE啟動子控制的cl基因表達產(chǎn)物是PL和PR啟動子轉(zhuǎn)錄的阻遏物,而其表達和在細胞中的濃度取決于一系列宿主與噬菌體因子這間的復(fù)雜平衡關(guān)系。通過細胞因子調(diào)節(jié)cl在細胞中含量的途徑很難操作,因此在構(gòu)建表達體系時,選用溫度敏感突變體cl1857(ts)的基因產(chǎn)物調(diào)控PL和PR啟動子的轉(zhuǎn)錄。10/8/202342常見的大腸桿菌表達系統(tǒng)T7表達體系:利用大腸桿菌T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)元件構(gòu)建的,具有很高表達能力的表達系統(tǒng)。T7噬菌體RNA聚合酶能選擇性地激活T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄,這是一種活性很高的RNA聚合酶,其合成mRNA的速率相當(dāng)于大腸桿菌RNA聚合酶的5倍。在大腸桿菌宿主細胞中,受T7噬菌體啟動子控制的基因在T7噬菌體RNA聚合酶存在下進行高表達。10/8/202343常見的大腸桿菌基因表達受體菌株菌株基因型啟動子BL21hsdSgalT7噬菌體HMS174recA1hsdRrifT7噬菌體M5279lacZtrpArpsLλ噬菌體PL
RB791W3110lacIqL8lac,tac10/8/202344大腸桿菌高效表達目的基因策略對表達相關(guān)元件進行優(yōu)化提高稀有密碼子tRNA的表達作用提高外源基因表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性優(yōu)化發(fā)酵過程提高外源基因mRNA的穩(wěn)定性10/8/202345表達相關(guān)元件的優(yōu)化主要包括與表達相關(guān)的啟動子序列和決定mRNA翻譯的SD序列。具體方法為組合強啟動子和強終止子;增加SD序列中與核糖體16SrRNA互補配對的堿基序列;調(diào)整SD序列與起始密碼ATG之間的距離及堿基的種類;防止核糖體結(jié)合位點附近序列轉(zhuǎn)錄后形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。10/8/202346表達質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計構(gòu)建表達質(zhì)粒時首先要考慮使目標(biāo)基因的翻譯起始密碼ATG與SD序列之間的距離和堿基組成處于一個適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。核糖體結(jié)合位點序列的變化對mRNA的翻譯效率有顯著影響,具體表現(xiàn)為:
SD序列UAAGGAGG的翻譯效率要比AAGGA高3~6倍翻譯起始密碼ATG與UAAGGAGG的最適距離是6~8個堿基長度,與AAGAA的最適距離是5~7個堿基長度ATG與UAAGGAGG至少相隔3~4個堿基,與AAGAA至少相隔5個堿基;mRNA的翻譯才能進行ATG與SD序列之間的堿基組成為A,T堿基豐富時,mRNA翻譯效率較高。10/8/202347
核糖體結(jié)合位點本身和附近的序列決定了目標(biāo)基因mRNA5’端的二級結(jié)構(gòu),研究表明討mRNA5’端形成的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)阻礙了mRNA與核糖體30S亞基的結(jié)合,從而抑制了翻譯的起始。盡量提高核糖體結(jié)合位點本身和附近的序列中A/T堿基的含量,降低mRNA5’端形成的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)的可能性,也是構(gòu)建表達質(zhì)粒時需要注意的事項。在必要的情況下,還可通過定點突變,PCR等技術(shù)改變個別關(guān)鍵的堿基來破壞mRNA5’端的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)。把目標(biāo)基因設(shè)計成多順反子結(jié)構(gòu),在大腸桿菌本身的高效翻譯起始元件后加上第二個SD序列和目標(biāo)基因,一起插入表達載體。這一方法通常適用于目標(biāo)基因5’端序列容易形成二級結(jié)構(gòu),而又不宜改變其序列的情形下10/8/202348表達質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計
在構(gòu)建表達質(zhì)粒時,充分利用各個基因的結(jié)構(gòu)特征和特點,注意引入翻譯增強子序列
能提高mRNA翻譯效率的特殊核苷酸序列,稱為翻譯增強子。
10/8/202349提高稀有密碼子tRNA的表達作用簡并密碼子的使用頻率不同與相應(yīng)tRNA在細胞中的豐度有關(guān)。過多使用低豐度tRNA時,會因tRNA耗盡而影響翻譯。可將外源基因中同義密碼子進行點突變,成為受體菌中常用密碼子而提高表達能力。10/8/202350共表達大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因表達水平高的基因呈現(xiàn)的密碼子偏愛性高于表達水平低的基因。
現(xiàn)已闡明的在大腸桿菌中的稀有密碼子有:編碼Arg的密碼子AGA、AGG、CGA、CGG編碼Pro的密碼子CCC、CCU、CCA編碼Cys的密碼子UGU、UGC;編碼Gly的密碼子GGA、GGG編碼Leu的密碼子CUA、CUC編碼Ile的密碼子AUA編碼Ser的密碼子UCA、AUG、UCG、UCC編碼Thr的密碼子ACA四、高效表達目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)10/8/202351共表達大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因
由于同義密碼子的使用頻率與細胞內(nèi)對應(yīng)的tRNA的豐度有正比關(guān)系稀有密碼子對應(yīng)的tRNA的豐度很低,有可能在翻譯過程中發(fā)生中止和移碼突變。
解決這一問題的辦法:通過基因突變把稀有密碼子改變?yōu)槠渌褂妙l率高的同義密碼子。在表達系統(tǒng)中共表達稀有密碼子tRNA基因,以提高大腸桿菌細胞內(nèi)稀有密碼子tRNA的豐度四、高效表達目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)10/8/202352提高外源基因表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性:大腸桿菌中含有多種蛋白水解酶,在外源基因表達產(chǎn)物的誘導(dǎo)下,其蛋白水解酶的活性可能會增加。因此必需提高外源蛋白在大腸桿菌細胞內(nèi)的穩(wěn)定性。常用的方法有:1、將外源基因的表達產(chǎn)物轉(zhuǎn)運到細胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中;2、選用某些蛋白水解酶缺陷株;3、對外源蛋白中水解酶敏感的序列進行修飾或改造;4、在表達外源蛋白的同時,表達外源蛋白的穩(wěn)定因子。10/8/202353提高外源基因mRNA的穩(wěn)定性:大腸桿菌的核酸酶系統(tǒng)能專一性地識別外源DNA或RNA并對其進行降解。為了保持外源mRNA在宿主細胞內(nèi)的穩(wěn)定性,可采取兩種措施:1、盡可能減少核酸外切酶對外源基因mRNA的降解;2、改變外源基因mRNA的結(jié)構(gòu),使之不易被酶降解。10/8/202354提高目標(biāo)基因mRNA和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性
由于大腸桿菌防御體系的自身保護作用,大腸桿菌中的核酸酶和蛋白水解酶能夠降解目標(biāo)基因mRNA和目標(biāo)基因產(chǎn)物,這種降解作用程度對不同的基因或蛋白質(zhì)而言是不同的,具有一定的專一性和選擇性。10/8/202355提高目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性的措施主要有:利用蛋白轉(zhuǎn)運系統(tǒng)把目標(biāo)蛋白最終累積在周質(zhì)空間,或分泌到培養(yǎng)基中采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌。對分子量較小的目標(biāo)基因進行融合表達或串聯(lián)聚合表達。共表達能提高特定目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性的輔助因子,如分子伴侶基因。對蛋白質(zhì)序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識別位點進行改造。在較低的溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件。10/8/202356
但必須指出的是,由于目標(biāo)蛋白本身的性質(zhì)和用途的不同,上述幾種方法在使用上是受到一定的限制的。主要表現(xiàn)為:大腸桿菌對分子量較大的目標(biāo)蛋白的較運和分泌效率一般比較低,不能滿足大規(guī)饃制備的需要。蛋白水解酶含量低的菌株往往代謝不旺盛,生長速率慢,使高密度發(fā)酵比較困難。融合表達使目標(biāo)蛋白的構(gòu)象與天然狀態(tài)不一樣,導(dǎo)致生物比活力降低,甚至沒有活性。融合蛋白和串聯(lián)聚合蛋白需要用酶或化學(xué)的方法切割出單體目標(biāo)蛋白。酶法成本比較高且加入的酶蛋白還必須分離去除。化學(xué)法比酶法成本低,但不少裂解試劑有毒性。對蛋白質(zhì)序列進行改造需要有基本的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù),而目前這方面的數(shù)據(jù)庫還不完整。10/8/202357優(yōu)化發(fā)酵過程:工藝的優(yōu)化生物學(xué)因素的優(yōu)化10/8/202358工藝的優(yōu)化擴大培養(yǎng)的條件優(yōu)化反應(yīng)器的優(yōu)化10/8/202359生物學(xué)因素的優(yōu)化溶氧量pH值溫度培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基的混合情況10/8/202360四、高效表達目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)高密度發(fā)酵和工程化宿主細胞
大腸桿菌高密度發(fā)酵是大規(guī)模制備重組蛋白質(zhì)過程中不可缺少的工藝步驟。其目的是在單個菌體對目標(biāo)基因的表達水平基本不變的前提下,通過單位體積的菌體數(shù)量的成倍增加來實現(xiàn)總表達量的提高。目前常用的發(fā)酵方式有:恒定培養(yǎng)、流加補料培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)三種
10/8/202361構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌
高密度發(fā)酵后期由于菌體的生長密度較高,培養(yǎng)基中的溶氧飽和度往往比較低,氧氣的不足導(dǎo)致菌體生長速率降低和乙酸的累積,乙酸的存在對目標(biāo)基因的高效表達有明顯的阻抑作用。這是高密度發(fā)酵工藝研究中最迫切需要解決的問題。雖然在發(fā)酵過程中可采取通氧氣,提高攪拌速度,控制補料速度等措施來控制溶氧飽和度,減少乙酸的產(chǎn)生。但從實際應(yīng)用上看,這些措施都有一定的滯后效應(yīng),難以做到比較精確的控制。因此構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌,是從恨本上解決問題的途徑之一。10/8/202362芽孢桿菌表達系統(tǒng)芽孢桿菌是對人畜無害的革蘭氏陽性土壤微生物。細菌細胞壁內(nèi)不含內(nèi)毒素,能分泌大量蛋白到胞外,目前已成為一些重要工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌種。10/8/2023631、多為非致病性微生物2、培養(yǎng)條件簡單,生長迅速3、表達產(chǎn)物能分泌到細胞外的培養(yǎng)基中,且多數(shù)表達產(chǎn)物具有天然構(gòu)象和生物學(xué)活性4、遺傳背景比較清楚,便于進行遺傳操作5、培養(yǎng)發(fā)酵技術(shù)比較成熟10/8/202364芽孢桿菌表達系統(tǒng)的不足1、芽孢桿菌分泌的蛋白酶量大、種類多,對外源基因表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性形成很大威脅2、載體不穩(wěn)定,易造成外源基因的丟失10/8/202365芽孢桿菌表達載體復(fù)制子:目前廣泛應(yīng)用于芽孢桿菌表達載體的復(fù)制子有:1、來源于金色葡萄球菌的復(fù)制子如pUB110、pC194和pE194等質(zhì)粒表達載體。2、來源于小芽孢桿菌的復(fù)制子如pHY481、pWT481等。10/8/202366芽孢桿菌表達載體啟動子:在利用芽孢桿菌表達體系時,必需使用芽孢桿菌能夠識別的啟動子。芽孢桿菌含有多種轉(zhuǎn)錄起始識別因子(σ),在芽孢桿菌中已鑒定的σ
已達十種。啟動子可被特異的σ
因子識別。芽孢桿菌啟動表達具有明顯的時序性,與菌體的生長周期和生理代謝活動密切相關(guān)。10/8/202367表達載體:1、自主復(fù)制質(zhì)粒芽孢桿菌的自主復(fù)制質(zhì)粒大多為無抗性標(biāo)志的隱蔽質(zhì)粒。帶有抗性標(biāo)志的自主復(fù)制質(zhì)粒主要來自其它革蘭氏陽性菌,如金黃色葡萄球菌如pUB110、pC194和pE194,并在這些質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建了雙標(biāo)記質(zhì)粒等載體。自主復(fù)制質(zhì)粒不穩(wěn)定,在復(fù)制過程中易發(fā)生丟失。10/8/2023682、整合質(zhì)粒:在大腸桿菌質(zhì)粒的基礎(chǔ)上增加一個芽孢桿菌的抗性標(biāo)志,以及待整合的目的基因。因其沒有芽孢桿菌的復(fù)制子,不能自主復(fù)制,整合到芽孢桿菌染色體后,隨細胞復(fù)制而復(fù)制。3、噬菌體:Φ105、SPβ及其它噬菌體均可作為芽孢桿菌的表達載體。其中Φ105是一種溫和噬菌體。10/8/202369宿主菌:野生型芽孢桿菌能分泌大量的胞外蛋白酶,影響外源基因表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性,因此在構(gòu)建芽孢桿菌表達系統(tǒng)宿主菌時要將蛋白酶基因進行突變,使其滅活或?qū)⒒钚越档?。目前?yīng)用較多的宿主菌主要有枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等。10/8/202370枯草芽孢桿菌能分泌6種不同的胞外蛋白酶,即枯草桿菌蛋白酶、胞外蛋白酶、金屬蛋白酶、桿菌肽酶及中性蛋白酶A和B。對其中3~5種胞外蛋白酶基因進行突變,可將胞外蛋白酶的活性降低至原來的1%;若將6種胞外蛋白酶基因全部突變,則胞外蛋白酶活性可降至原來的0.3%左右。10/8/202371短小芽孢桿菌表達體系的優(yōu)點:1、能對許多蛋白質(zhì)進行分泌表達2、胞外蛋白酶活性較低3、短小芽孢桿菌分泌胞外蛋白酶的同時還能產(chǎn)生蛋白酶抑制劑,不同短小芽孢桿菌分泌抑制劑的能力不同,使胞外蛋白酶的活性差異很大10/8/2023724、細胞壁的結(jié)構(gòu)由三層組成,最外兩層為蛋白層,內(nèi)層為肽聚糖。細胞壁的結(jié)構(gòu)與細胞的生長周期有關(guān)。在生長穩(wěn)定前期,細胞壁的外層和中層蛋白開始從細胞表面脫落,分泌型蛋白開始表達;進入穩(wěn)定期后,細胞壁的蛋白層全部脫落,細胞壁蛋白仍然表達導(dǎo)致細胞壁蛋白在培養(yǎng)基中大量累積。10/8/2023735、利用細胞壁蛋白基因的啟動區(qū)、操縱區(qū)、翻譯起始區(qū)和蛋白質(zhì)信號肽序列等元件表達外源基因,可使外源基因在小芽孢桿菌表達系統(tǒng)中獲得高效分泌表達。10/8/202374芽孢桿菌中高效表達的策略1、提高表達質(zhì)粒在細胞中的穩(wěn)定性:以金黃色葡萄球菌為基礎(chǔ)構(gòu)建的一系列質(zhì)粒在進行滾環(huán)復(fù)制時會產(chǎn)生許多單鏈DNA,這些單鏈DNA的存在會對質(zhì)粒DNA造成影響,在沒有選擇壓力的情況下易發(fā)生丟失;某些表達質(zhì)粒載體還含有染色體DNA同源序列,在細胞分裂的過程中可發(fā)生同源交換,導(dǎo)致質(zhì)粒的消失。10/8/2023752、構(gòu)建新型的表達質(zhì)粒:通過消除表達載體中與宿主菌染色體DNA的同源序列3、構(gòu)建整合型質(zhì)粒:利用質(zhì)粒中與染色體的同源序列構(gòu)建整合型質(zhì)粒,使目的基因整合到染色體上4、滅活芽孢桿菌胞外蛋白酶10/8/202376鏈霉菌表達系統(tǒng)鏈霉菌是一類好氧、絲狀的革蘭氏陽性細菌,廣泛存在于土壤中,能夠產(chǎn)生多種生理活性物質(zhì)。鏈霉菌的染色體為線狀結(jié)構(gòu),在中間含有復(fù)制起始點和共價結(jié)合的末端蛋白,DNA不穩(wěn)定,有時會出現(xiàn)缺失而環(huán)化,但對細菌生長沒有嚴(yán)重影響。10/8/202377鏈霉菌表達系統(tǒng)的特點;1、為非致病性細菌,不產(chǎn)生內(nèi)毒素2、可進行外源蛋白的分泌表達3、可進行高密度培養(yǎng),具有豐富的次級代謝途徑和初、次級代謝調(diào)控體系,表達外源蛋白的時間較長4、鏈霉菌在傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用歷史悠久,有良好的工業(yè)化基礎(chǔ)10/8/202378鏈霉菌表達載體啟動子:鏈霉菌基因啟動子的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為多樣性,至少存在三類鏈霉菌基因啟動子:1、與大腸桿菌基因-10區(qū)和-35區(qū)類似的啟動子,-10區(qū)堿基序列通常為5’TAGPuPuT3’,-35區(qū)堿基序列為5’TTGCPu3’,這種啟動子序列可被大腸桿菌RNA聚合酶識別,這類啟動子一般在細菌對數(shù)生長期啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。10/8/2023792、僅與大腸桿菌基因-10區(qū)類似的啟動子。3、與大腸桿菌基因-10區(qū)與-35區(qū)序列均不相同的啟動子。終止子:鏈霉菌基因終止子結(jié)構(gòu)具有較長的不完全互補反向重復(fù)序列,能形成發(fā)卡結(jié)構(gòu),在多數(shù)情況下不含寡聚T序列,轉(zhuǎn)錄終止位點位于終止子結(jié)構(gòu)下游的鄰近區(qū)域10/8/202380核糖體結(jié)合位點:鏈霉菌基因核糖體結(jié)合位點的序列類似于其他原核生物的SD序列:5’(a/g)GGAGG3’相對于其他革蘭氏陽性細菌而言,鏈霉菌基因中核糖體序列的保守性略低,與起始密碼之間的距離為5~12個堿基。鏈霉菌基因轉(zhuǎn)錄起始位點與編碼區(qū)之間的距離變化也較大,從數(shù)個bp到幾百個不等。10/8/202381密碼子:鏈霉菌對編碼蛋白質(zhì)的密碼子具有明顯的偏愛性。對數(shù)十種鏈霉菌蛋白質(zhì)的密碼子進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),編碼蛋白質(zhì)的堿基序列中GC的平均含量高達73%,密碼子的第一、第二和第三位堿基的GC含量分別為66%、53%和93%。有些簡并密碼子的使用頻率不足2%。10/8/202382鏈霉菌表達載體1、高拷貝載體:普遍采用的是pIJ101,在鏈霉菌中的拷貝數(shù)為40~800。通常加入硫鏈絲霉素、紅霉素、紫霉素和新霉素作為抗性選擇性標(biāo)記。pIJ702是pIJ101的衍生質(zhì)粒,含有mel(酪氨酸酶)和tsr基因作為選擇性標(biāo)記。外源基因可插入滅活mel基因,因不產(chǎn)生黑色素而非常方便使用。10/8/2023832、低拷貝載體:由SCP2*衍生的質(zhì)粒pIJ922和940等,可接受較大的外源基因,但只有1~2個拷貝。3、穿梭質(zhì)粒載體:可在大腸桿菌中完成構(gòu)建和復(fù)制,在鏈霉菌細胞中進行表達。4、噬菌體載體10/8/202384宿主菌:鏈霉菌基因表達系統(tǒng)的宿主菌主要有變鉛青鏈霉菌和天藍色鏈霉菌。天藍色鏈霉菌是整個霉菌中分子遺傳學(xué)研究最清楚的菌株,但有較強的修飾系統(tǒng),因而在實際應(yīng)用中都是以變鉛青鏈霉菌作為外源基因表達的受體菌系統(tǒng)。10/8/202385變鉛青鏈霉菌表達外源基因的優(yōu)點1、遺傳背景清楚,不含內(nèi)源性質(zhì)粒2、對外源DNA無明顯的修飾作用3、能夠高效表達鏈霉菌基因以外的其他基因;4、具有高效的異源蛋白分泌系統(tǒng),并且其內(nèi)源蛋白酶和外源蛋白酶合成量低。10/8/202386在鏈霉菌中高效表達外源基因的策略影響外源基因在鏈霉菌中表達的因素包括:啟動子的特性信號肽的序列基因的結(jié)構(gòu)和發(fā)酵條件等10/8/202387啟動子的影響:鏈霉菌RNA聚合酶能識別某些原核生物的啟動子,但
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