儀器分析-藥物定量分析與分析方法驗證

第四章藥物定量分析與分析方法驗證第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法

不經有機破壞:

直接測定法(富馬酸亞鐵的含量測定)經水解后測定法(硬脂酸鎂的含量測定)經氧化還原后測定(泛影酸的含量測定)需經有機破壞：

濕法破壞干法破壞氧瓶燃燒法定量分析樣品的前處理方法---不經有機破壞

直接測定法

適用于金屬原子不直接與碳原子相連的含金屬藥物或金屬原子與碳原子結合不牢固的有機金屬藥物。如富馬酸亞鐵的含量測定。結構式如下：經水解后測定法1）直接回流后測定法（如三氯叔丁醇）原理三氯叔丁醇在氫氧化鈉溶液中加熱回流水解，氯元素全部轉變成氯化鈉，然后用剩余滴定法，即于水解液中加硝酸酸化，再加入定量過量的硝酸銀滴定液，使Cl-生成AgCl沉淀，過量的硝酸銀，以Fe3+為指示劑，用硫氰酸銨溶液回滴定。2）用硫酸水解后測定法（如硬脂酸鎂---指示劑?）定量分析樣品的前處理方法---不經有機破壞

經氧化還原后測定

1）堿性還原后測定（如泛影酸---指示劑曙紅鈉）本法適用于測定結構中碘與苯環(huán)直接相連，且一個苯環(huán)上含多個碘原子的含鹵素有機藥物。定量分析樣品的前處理方法---不經有機破壞

2）酸性還原后測定（如碘番酸---指示劑四溴酚酞）定量分析樣品的前處理方法---不經有機破壞

3）利用藥物中可游離的金屬離子的氧化性測定含量 葡萄糖酸銻鈉的測定-淀粉指示劑ChP2005）定量分析樣品的前處理方法---不經有機定量分析樣品的前處理方法---需經有機破壞濕法破壞硝酸-高氯酸法：適用于生物樣品的破壞；不適用于含氮雜環(huán)藥物的破壞硝酸-硫酸法：適用于多數(shù)有機藥物的破壞；不適用于含堿土金屬有機藥物的破壞硫酸-硫酸鉀法：適用于含砷或銻有機藥物的破壞硝酸-硫酸-高氯酸法等

干法破壞適用于濕法不易破壞完全的有機物及不能用硫酸破壞的；不適用于含易揮發(fā)性金屬有機藥物。氧瓶燃燒法本法特點是設備簡單，快速分解、破壞完全，尤其適用于微量樣品的分析定量分析樣品的前處理方法---需經有機破壞氧瓶燃燒法原理氧瓶燃燒法：將有機藥物放入充滿氧氣的密閉燃燒瓶中進行燃燒，并將燃燒所產生的欲測物質吸收于適當?shù)奈找褐校缓蟾鶕?jù)欲測物質的性質，采用適宜的分析方法進行鑒別、檢查或含量測定適用于含鹵素、硫、氮、硒等有機藥物的分析 儀器裝置 稱樣要求 具體操作 吸收液的作用:是將樣品經燃燒分解所產生的各種價態(tài)的鹵素、硫、氮、硒等，定量地吸收并轉變?yōu)橐欢ǖ谋阌跍y定的價態(tài)吸收液的選擇

氟水

氯NaOH溶液溴H2O2-NaOHNaOH-硫酸肼飽和溶液碘NaOH－硫酸肼飽和溶液硫NaOH或H2O2

硒硝酸溶液注意事項①根據(jù)被燃燒分解的樣品量選用適宜大小的燃燒瓶---ChP（2005）規(guī)定的燃燒瓶體積為500、1000或2000ml三種，采用常量或半微量分析②測定含氟有機藥物時，用石英制燃燒瓶 ③鉑絲燃燒時起催化作用 ④應同時做空白試驗 ⑤燃燒時要注意防爆⑥燃燒要完全⑦燃燒產生的煙霧完全被吸收第二節(jié)定量分析方法的特點容量分析法光譜分析法色譜分析法一、容量分析法1.概念容量分析法是將已知濃度的滴定液由滴定管滴加到待測藥物的溶液中，直到所加滴定液與被測藥物按化學計量反應完全為止，然后根據(jù)滴定液的濃度和消耗的體積，就可以計算出被測藥物的含量。

2、容量分析法的特點需要重量分析中沉淀的過濾、洗滌、灼燒、恒重等一系列操作。通常用于測定高含量或中含量組分，即被測組分的含量在1%以上。

比較準確，一般情況下相對誤差可達0.2%以下。所用儀器普通易得。3、容量分析法----需注意的問題滴定誤差

滴定終點與等當點不一定恰好符合，二者之間存在誤差

。需要選擇合適的指示劑，使滴定終點盡可能接近等當點。

4、容量分析法----計算滴定度

指每1ml某摩爾濃度的滴定液所相當?shù)谋粶y藥物的重量。中國藥典用毫克(mg)表示。如：用碘量法測定維生素C含量時，規(guī)定“每1ml的碘滴定液(0.1mol／L)相當于8.806mg的維生素C”；

容量分析法----滴定度（T） 被測藥物(B)與滴定液(A)之間按一定的摩爾比進行反應：aA+bB

cC+dD滴定度(T)可按下式計算：T=M*b/a*B(mg／ml)M：滴定液的摩爾濃度b：被測藥物的摩爾數(shù)a：滴定液的摩爾數(shù)B：被測藥物的分子量

容量分析法---百分含量計算直接滴定法用滴定液直接滴定，以求得被測藥物的含量。回滴定法(剩余滴定法)

先加入定量過量的滴定液A，使其與被測藥物反應，待此反應進行完全后，再用另一滴定液B來回滴反應中剩余的滴定液A。

直接滴定法含量%=V*T/W*l00％W：供試品取量V：消耗滴定液的體積T：滴定度 實際工作中，所配制的的滴定液的摩爾濃度與藥典中規(guī)定的摩爾濃度不一定恰好符合，此時就不能直接應用藥典上所給出的滴定度(T)，但可換算成實際的滴定度(T')：T'=T*F F（校正因數(shù)）=實際摩爾濃度/規(guī)定摩爾濃度被測藥物的百分含量可由下式求得：回滴定法不做空白試驗時百分含量計算：VA：先加入的定量過量的滴定液A體積VB：為滴定液B消耗體積FA：滴定液A濃度校正因數(shù)FB：滴定液B濃度校正因數(shù)W：供試品取量T：滴定度。

做空白試驗時百分含量計算：V0：空白試驗消耗硫酸滴定液體積VB：樣品測定試驗消耗滴定液體積T：滴定度F：為滴定液濃度校正因數(shù)W：供試品取樣量(g)

二、光譜分析法 當物質與輻射能相互作用時，物質內部發(fā)生能級躍遷。記錄由能級躍遷所產生的輻射能隨波長的變化所得的圖譜稱為光譜，利用物質的光譜進行定性、定量和結構分析的方法稱為光譜分析法，簡稱光譜法。紫外—可見分光光度法熒光分析法原子吸收分光光度法紅外分光光度法

紫外可見分光光度法 根據(jù)物質分子對波長為200nm~760nm這一范圍的電磁波的吸收特性所建立起來的光譜分析方法。原理：朗伯-比耳定律 靈敏度高，可達10-4g／ml~10-7g／ml.

準確度高，相對誤差為2％~5％。儀器價格較低廉，操作簡單；易于普及。應用廣泛。(許多化合物都可以采用此法進行測定，應用計算分光光度法可不經分離而直接測定混合物中各組分的含量。)紫外可見分光光度法原理朗伯-比耳定律可表示如下：A=E*C*lA：吸收度；l：液層厚度；C：溶液濃度；E：吸收系數(shù)，即單位濃度、單位液層厚度時的吸收度。

紫外可見分光光度法吸收系數(shù)摩爾吸收系數(shù)（ε）：在一定波長下，溶液濃度為1mol／L，厚度為1cm時的吸收度，多用于研究分子結構。百分吸收系數(shù)（）：在一定波長下，溶液濃度為1%(W／V)，厚度為1cm時的吸收度，多用于定量測定。兩者之間的關系為=ε*10/M

M：吸光物質的分子量(即摩爾質量)

紫外可見分光光度法吸收系數(shù)ε值的大小反映了物質對某一波長光的吸收能力，也反映測定反應的靈敏度。ε一般不超過105數(shù)量級，通常ε達104的為強吸收；102~104為中吸收；小于102的為弱吸收。吸收系數(shù)都不能直接測得，而必須采用適宜的已知準確濃度的稀溶液測得吸收度A后計算求得。

紫外可見分光光度法儀器校正和檢定 由于溫度變化對機械部分的影響，儀器的波長經常會略有變動。定期對所用儀器進行全面校正檢定測定前校正測定波長。

常用汞燈中的較強譜線或用儀器中氘燈的譜線進行校正。吸收度的準確度

可用重鉻酸鉀的硫酸溶液檢定。

紫外可見分光光度法對溶劑的要求

測定供試品之前，應先檢查所用的溶劑在供試品所用的波長附近是否符合要求，即用1cm石英吸收池盛溶劑，以空氣為空白（即光路中不置任何物質）測定其吸收度，溶劑和吸收池的吸收度220nm~240nm：不得超過0.40；

24lnm~250nm：不得超過0.20；251nm~300nm：不得超過0.10；300nm以上：不得超過0.05。

紫外可見分光光度法測定法

以配制供試品溶液的同批溶劑為空白對照，采用1cm的石英吸收池，在規(guī)定的吸收峰波長±2nm以內測試幾個點的吸收度，以核對供試品的吸收峰波長位置是否正確。吸收峰波長應在該品種項下規(guī)定的波長士1nm以內；否則應考慮試樣的真?zhèn)危兌纫约皟x器波長的準確度，并以吸收度最大的波長作為測定波長。一般供試品溶液的吸收度讀數(shù)，以在0.3-0.7之間的誤差較小。由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，所以測定供試品溶液的吸收度后應減去空白讀數(shù)，再計算含量。

紫外可見分光光度法含量測定方法對照品比較法

吸收系數(shù)法

計算分光光度法

紫外可見分光光度法含量測定方法

對照品比較法

分別配制供試品溶液和對照品溶液，對照品溶液中所含被測成分的量應為供試品溶液中被測成分標示量的100±10%，所用溶劑也應完全一致，在規(guī)定的波長測定供試品溶液和對照品溶液的吸收度后計算。

Cx：供試品溶液的濃度；Ax：供試品溶液的吸收度；Cr：對照品溶液的濃度；Ar：對照品溶液的吸收度；D：稀釋倍數(shù)；W：供試品取樣量。

紫外可見分光光度法含量測定方法

吸收系數(shù)法 配制供試品溶液，在規(guī)定的波長處測定其吸收度，再以該品種在規(guī)定條件下的吸收系數(shù)計算含量。

用本法測定時，應注意儀器的校正和檢定。

紫外可見分光光度法含量測定方法

計算分光光度法

采用計算分光光度法應慎重。方法有多種，使用時均應按各品種項下規(guī)定的方法進行。當吸收度處在吸收曲線的陡然上升或下降的部位測定時，影響精度的因素較多，故對照品和供試品測試條件應盡可能一致。若測定時不用對照品，如維生素A測定法，則應在測定時對儀器作仔細地校正和檢定。

熒光分析法 某些物質受紫外光或可見光照射激發(fā)后能發(fā)射出比激發(fā)光波長較長的熒光。當激發(fā)光停止照射后，熒光隨之消失。同一種分子結構的物質，用同一波長的激發(fā)光照射，可以發(fā)射相同波長的熒光。當激發(fā)光強度、波長、所用溶劑及溫度等條件固定時，物質在一定濃度范圍內，其熒光強度(也叫發(fā)射光強度)與溶液中該物質的濃度成正比關系，可以用作定量分析。

熒光分析法的特點靈敏度高，可達10-10g／ml~10-12g/ml熒光分析法應在低濃度溶液中進行。干擾因素也多，因此必須做空白試驗。對易被光分解的樣品，可選擇一種激發(fā)光和發(fā)射光波長與之近似而對光穩(wěn)定的物質配成適當濃度的溶液作為基準溶液代替對照品溶液校正儀器的靈敏度。熒光衍生試劑可擴大熒光分析法的應用范圍。取樣少，方法快速。

熒光分析法的含量測定方法 由于不易測定絕對熒光強度，故熒光分析法都是在一定條件下，用對照品溶液測定熒光強度與濃度的線性范圍后，再在每次測定前，用一定濃度的對照品溶液校正儀器的靈敏度；然后在相同條件下，讀取對照品溶液及其試劑空白的熒光讀數(shù)與供試品溶液及其試劑空白的熒光讀數(shù)計算供試品濃度。

熒光分析法的含量測定的計算Ci：供試品溶液濃度；Cr：對照品溶液濃度；Ri：供試品溶液讀數(shù)；Rib：供試品溶液試劑空白的讀數(shù)；Rr：對照品溶液的讀數(shù)；Rrb：對照品溶液試劑空白的讀數(shù)

*因熒光分析法中的濃度與讀數(shù)的線性較窄，故(Ri-Rib)／(Rr-Rrb)應在0.50~2.0之間，如有超過，應在調節(jié)溶液濃度后再測。

三、色譜分析法

色譜分析法是一種分離分析方法，它先將各組分從混合物中分離再逐個分析，因此是分析混合物的最有力手段。此法具有高靈敏度(可達10-12g／ml~10-15g/ml)、高選擇性、高效能、高速度及應用廣泛等特點。

根據(jù)其分離原理可分為： 吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜與排阻色譜等。根據(jù)分離方法分為： 紙色譜法、薄層色譜法、柱色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。1、色譜分析法---高效液相色譜法

用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，經進樣閥注入供試品，由流動相帶入柱內，在柱內各成分被分離后，依次進入檢測器，色譜信號由記錄儀或積分儀記錄。

高效液相色譜法一般要求常用的色譜柱填充劑：硅膠和化學鍵合硅膠(十八烷基硅烷鍵合硅膠、辛基硅烷鍵合硅膠、氰基或氨基鍵合硅膠）離子交換填充劑：用于離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等填充劑：用于分子排阻色譜等。進樣量：一般為數(shù)微升。

除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。

流動相：常以甲醇、水、乙腈、緩沖液、反離子物質等。

高效液相色譜法一般要求流動相及供試品溶液：應澄清，要求用濾器過濾后使用或進樣。如果流動相中有緩沖劑，每日使用后應用不含緩沖劑的流動相將儀器管路、泵、進樣閥、色譜柱、檢測池等充分沖洗。色譜柱保存：應保持填料在濕潤狀態(tài)，兩端密塞，可按說明書要求保存。十八烷基硅烷鍵合硅膠可在甲醇中保存，硅膠可在己烷中保存。

高效液相色譜法一般要求色譜柱型號選用及注意：色譜柱長度不能決定分離效果，較好的填料用短柱即可；流動相流速應取決于柱內徑及柱效；由于柱效及柱子性能不同，流動相各組分比例需調整；在用十八烷基硅烷鍵合相色譜柱時，色譜峰如果保留時間太長可增加甲醇比例，使其前移，反之可使之后移。如果柱效略嫌低，可以適當提高色譜柱柱溫。

高效液相色譜法----系統(tǒng)適用性試驗用規(guī)定的對照品對儀器進行試驗和調整，應達到規(guī)定的要求；或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的最小理論板數(shù)、分離度、重復性和拖尾因子。

高效液相色譜法----系統(tǒng)適用性試驗色譜柱的理論板數(shù)(n)：在選定條件下，注入供試品溶液或規(guī)定的內標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內標物質峰的保留時間（tR）和半峰高寬(Wh/2)

n=5.54(tR／Wh/2)2如測得理論板數(shù)低于規(guī)定的最小理論板數(shù)，應改變色譜柱的條件(如柱長、載體性能、色譜柱充填的優(yōu)劣等)，使理論板數(shù)達到要求。

高效液相色譜法----系統(tǒng)適用性試驗分離度：定量分析時：為便于準確測量，要求定量峰與其他峰或內標峰之間有較好的分離度，分離度(R)的計算公式為：tR1：相鄰兩峰中后一峰的保留時間；tR2：相鄰兩峰中前一峰的保留時間；Wl及W2：此相鄰兩峰的峰寬；*除另有規(guī)定外，分離度應大于1.5。

高效液相色譜法----系統(tǒng)適用性試驗重復性：取各品種項下的對照溶液，連續(xù)進樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值均相對標準偏差應不大于2.0％。也可按各品種校正因子測定項下，配制相當于80％、10