雙向電泳實(shí)驗(yàn)

雙向電泳

基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)基因組學(xué)：蛋白質(zhì)組學(xué)：可視為分子生物學(xué)的大規(guī)模篩選技術(shù)，目的在于歸類細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的整體分布，鑒定并分析感興趣的個(gè)別蛋白，最終闡明它們的關(guān)系與功能。上述兩種學(xué)科的研究內(nèi)容在互補(bǔ)的水平上研究了細(xì)胞的分子架構(gòu)，又都在各自的水平上提供了增強(qiáng)對方效應(yīng)的信息，因此二者存在有很強(qiáng)的且?guī)в邢到y(tǒng)性相互關(guān)系。Applicationsofproteomics?

Proteinidentification/characterization?Protein-proteininteraction?Post-translationalmodifications?Subcellularlocation?Elucidationofpathway?Targetvalidationandtoxicology?Drugdiscovery蛋白質(zhì)組分析的首要要求將來自于全細(xì)胞、組織或生物體中所包含的多達(dá)幾千種混合蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、檢測和分析。2-DE技術(shù)依然是大多數(shù)蛋白質(zhì)組研究中分離復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的首選技術(shù)。生物學(xué)問題的提出實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和對照組樣品的制備蛋白樣品的IEF和PAGE電泳分離圖像掃描和初步分析感興趣蛋白點(diǎn)的切取胰酶對脫色后蛋白質(zhì)的消化質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測序分析質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白信息的初步獲得蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線蛋白質(zhì)樣品的制備雙向電泳圖像分析轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白凝膠中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白質(zhì)質(zhì)量N端測序肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù)肽指紋圖數(shù)據(jù)搜索新的或已知蛋白蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定一、樣品制備制備的一般原則：盡可能提高蛋白樣品的溶解度（包括多數(shù)疏水性蛋白），抽提最大量的總蛋白，減少蛋白質(zhì)的損失；且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。（最關(guān)鍵因素）減少對蛋白質(zhì)的人為修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。完全去除樣品中的核酸。（超聲、核酸酶）盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。增加樣品溶解性的手段1、變性劑：將蛋白疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫脲。2、表面活性劑：經(jīng)變性劑處理后用來溶解疏水基團(tuán)。常用的表面活性劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑TritonX-100和NP-40、兩性離子去污劑CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。3、還原劑：在變性劑和表面活性劑聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的DTT或

-巰基乙醇，以及不帶電荷的磷酸三丁酯（TBP）進(jìn)行還原。4、起載體作用的兩性電解質(zhì)：某些蛋白質(zhì)需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否則這些蛋白質(zhì)在其處于PI點(diǎn)時(shí)會(huì)發(fā)生沉淀。Carrierampholytes的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。應(yīng)用時(shí)，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于0.2％（w/v)。濃度過高會(huì)使IEF的速度降低。另外，為了保證實(shí)驗(yàn)的精確性，在選擇不同pH范圍的IPG膠條時(shí)，也應(yīng)使兩性電解質(zhì)的pH值與之相符合?？扇苄詷悠?/p>

固體組織樣品

細(xì)胞不同樣品的基本處理方法不同樣品的分級(jí)處理通過采用亞細(xì)胞分級(jí)、液相電泳和選擇性沉淀等方法對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分級(jí)處理，可降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)。當(dāng)前最簡單有效的處理是采用分級(jí)抽提，按樣品溶解度不同進(jìn)行分離。常用細(xì)胞裂解液ReagentFinalconcentrationurea7MThiourea2MCHAPS4%Pharmalyte0.2%(臨用前加)DTT40mM(臨用前加)混合酶抑制劑特殊樣品的制備低豐度蛋白的分離：盡管增加上樣量和提高總蛋白的溶解度能增加分離時(shí)的低豐度蛋白的量，但同時(shí)增加了高豐度蛋白的負(fù)荷，且造成蛋白的疊加效應(yīng)而影響分離?，F(xiàn)常用預(yù)分級(jí)＋窄pH膠的微制備技術(shù)進(jìn)行分離：即將總蛋白組分成蛋白質(zhì)組亞群，再用pH梯度小于2個(gè)pH單位的IPG膠進(jìn)行窄pH范圍的分離。

強(qiáng)堿性蛋白質(zhì)（如核糖體）的處理：先將蛋白預(yù)處理以富集，再用特殊pH梯度的IPG膠條（如pH3－12、4-12或10-12）進(jìn)行等電聚焦。其中窄范圍堿性IPG膠（如pH10-12）的挑戰(zhàn)是克服反向、陰極向陽極、電滲流和水平條紋模式，而寬范圍的堿性IPG膠（如pH3-12、4-12）等消除了窄范圍膠所需要的專門水化液。極端分子量的蛋白質(zhì)：小于8kD和大于200kD的蛋白在常規(guī)IPG-2D上不易看到，這可能是在Tris/glycine緩沖液中，樣品和游離的dodelcylsulfateions持續(xù)積累濃縮，與小分子量的蛋白質(zhì)發(fā)生對流混合，產(chǎn)生茸毛狀的或模糊的帶，從而降低小蛋白的分辨率；在膠底端，高濃度的十二磺酸使蛋白固定致染色困難。至于高分子量蛋白少的原因可能是在變性條件下，蛋白質(zhì)復(fù)合物變成了多肽，或者可能是大分子。二、一維固相pH梯度等電聚焦

（IEFwithIPG）IPG膠的材料是Immobilines，為擁有CH2=CH-CO-NH-R結(jié)構(gòu)的8種丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基團(tuán)，它們構(gòu)成了分布在pH3~10不同值的緩沖體系。根據(jù)公布的配方計(jì)算后，將適宜的IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團(tuán)通過乙烯鍵共價(jià)聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通過這種方式生成的IPG不會(huì)發(fā)生電滲透作用，因而可以進(jìn)行特別穩(wěn)定的IEF分離達(dá)到真正的平衡狀態(tài)。IPG膠條的重泡脹泡脹的實(shí)質(zhì)：是讓樣品能完全以可溶性的形式進(jìn)入IPG內(nèi)，從而能進(jìn)行接下來的IEF。蛋白載樣量影響IPG膠條對蛋白載樣量的因素包括：待分析的蛋白點(diǎn)的量應(yīng)滿足隨后的質(zhì)譜分析。電泳的目的：如果只是得到一張好的圖片，則無需考慮太多其它因素。待研究蛋白的豐度：樣品的復(fù)雜度：復(fù)雜度較高的樣品，為了盡可能的了解所包含的每種蛋白，需要反復(fù)實(shí)驗(yàn)才能完成。如果將待檢樣品被富集以后則更易分析。IPG膠條的pH范圍：IPG膠條的蛋白質(zhì)大約載樣量IPGStriplengthAnalyticalLoad(silverstaining)PreparativeLoad(Coomstaining)7cm10~100

g/125

l200~500ug/125

l11cm50~200

g/185

l250~1000ug/185

l17cm100~300

g/300

l1~3mg/300

lIPGIEF中pH梯度的選擇

常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長，預(yù)試驗(yàn)確定。預(yù)分步收集細(xì)胞漿細(xì)胞核細(xì)胞膜核糖體及其他特定細(xì)胞成份細(xì)胞分泌成份pH4-12pH3-10pH4-7pH5-8pH7-10pH6-11pH3-6pH3-4pH4-5pH5-6pH6-7pH7-8pH8-9pH9-10pH10-11pH11-12第一步第二步第三步用窄pH范圍陣列分離低豐度或交叉覆蓋蛋白陣列那些亞細(xì)胞定位位置的功能蛋白質(zhì)亞蛋白質(zhì)組陣列策略的框架圖3倍3倍聚焦時(shí)間的優(yōu)化

理論上講，要獲得最好的圖譜質(zhì)量和重復(fù)性所需最佳時(shí)間是IEF分離達(dá)到穩(wěn)定態(tài)所需的時(shí)間。聚焦時(shí)間太短，會(huì)導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。過度聚焦雖然不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會(huì)因?yàn)榛钚运D(zhuǎn)運(yùn)而導(dǎo)致過多水在IPG膠表面滲出（電滲）而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。最佳時(shí)間的確定需要根據(jù)不同蛋白樣品、上樣量、pH范圍和膠條長度通過經(jīng)驗(yàn)來確定。IEF的基本條件Stemp1Stemp2Stemp3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020min－－－Linear400040002hr－－－－－－10,000V-hrLinearRapid5hr14,000V-hr7cmStemp1Stemp2Stemp3totaltotalStemp1Stemp2Stemp311cm17cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr－－－－－－－－－－－－－－－－－－20,000V-hr40,000V-hr～30,000V-hr～50,000V-hr5.3hr7hrLinearLinearLinearLinearRapidRapid三、兩維間的平衡

一維結(jié)束后可馬上進(jìn)行二維電泳，也可保存在兩片塑料膜間于－80°保存數(shù)月。但在二維電泳前一定要進(jìn)行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與SDS完整結(jié)合，從而在SDS是電泳能順利進(jìn)行。建議方案是：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mMTris（pH8.8）緩沖液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述緩沖液平衡15min。四、二維SDS同普通SDS類似。但一般在垂直電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠，因?yàn)樵贗PG膠條中蛋白質(zhì)區(qū)域已得到濃縮，可以認(rèn)為非限制性IEF膠（低濃度丙烯酰胺膠）充當(dāng)了濃縮膠。聚丙烯酰胺凝膠和轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白質(zhì)的檢測理想顯色劑的7S安全（safety）：靈敏（sensitivity）：簡單（simplicity）：特異性（specificity）：快速（speed）：穩(wěn)定（stability）：兼容性（synergy）：五、有機(jī)染料和銀染考染靈敏度為30~100ng，線性范圍是20倍；銀染的線性范圍是40倍，靈敏度是考染的100倍。膠體考馬斯亮藍(lán)染色技術(shù)可實(shí)現(xiàn)PAGE的無背景