植物生理與分子生物學(xué)：雄性發(fā)育的分子遺傳和進(jìn)化生物學(xué)研究

雄性發(fā)育的分子遺傳和進(jìn)化生物學(xué)研究內(nèi)容1.花藥早期發(fā)育中的受體蛋白激酶

和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要作用

2.減數(shù)分裂中同源重組關(guān)鍵基因的

分子遺傳分析和相關(guān)基因家族的

分子進(jìn)化研究植物的雄性發(fā)育對產(chǎn)量有顯著影響

Plantmaledevelopmentgreatlyimpactyield正常雄性育性依賴花藥的正常形成和發(fā)育研究花藥發(fā)育的調(diào)控機(jī)制可以幫助對農(nóng)作物雄性育性的認(rèn)識，有助于提高農(nóng)作物產(chǎn)量正常的花藥發(fā)育決定了水稻的產(chǎn)量Normalantherdevelopmentcontrolriceyield小麥育種專家—李振聲院士雜交水稻之父—袁隆平院士雄性不育體系是雜交育種的重要材料

Malesterilelinesarekeymaterialsforhybridcrops常用雄性不育材料多為胞質(zhì)型不育，需要“恢復(fù)系”核基因不育體系可成為誘導(dǎo)型材料，是“兩系”雜交系統(tǒng)的基礎(chǔ)認(rèn)識花藥發(fā)育有助于新的不育體系的建立花藥早期發(fā)育決定了雄性育性是否正常

Antherearlydevelopmentcrucialfornormalmalefertility花藥正常細(xì)胞分裂和分化決定了花粉的形成、數(shù)量和質(zhì)量花藥細(xì)胞的分裂和分化是雄性育性的核心之一農(nóng)作物和模式植物花藥的結(jié)構(gòu)和已知基因功能非常相似內(nèi)皮中層絨氈層花粉

母細(xì)胞藥室表皮模式植物擬南芥是研究花藥發(fā)育的優(yōu)良體系

Arabidopsisisanexcellentmodelsystem

forstudyingantherdevelopment植物花藥早期發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

Keystagesofearlyantherdevelopment細(xì)胞分裂Celldivision花藥發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)為三輪體細(xì)胞分裂和生殖細(xì)胞的分裂，四種體細(xì)胞的分化，和生殖細(xì)胞的形成細(xì)胞分化Celldifferentiation表皮內(nèi)皮中層絨氈層花粉母細(xì)胞體細(xì)胞Stage5Stage6減數(shù)分裂時期的花藥細(xì)胞AntherCellsattheMeioticStageSandersetal.,1999Sex.PlantReprod.Stage7Stage9花粉發(fā)育時期的花藥細(xì)胞AntherCellsDuringPollenDevelopmentSandersetal.,1999Sex.PlantReprod.花藥早期發(fā)育的調(diào)控Controlofearlystepsofantherdevelopment花藥中的藥室的數(shù)量是怎么控制的？Howisthe4-lobedpatterncontrolled?ER/ERL1/2調(diào)節(jié)雄性育性

ER/ERL1/2regulatemalefertility

ER,ERL1,ERL2受體蛋白激酶具有多個功能,包括控制植株高度、果實(shí)發(fā)育等er,erl1,erl2

單突變的育性正常三種雙突變的育性也是正常的ererl1erl2三突變則幾乎完全不育ER/ERL調(diào)節(jié)花藥藥室的形成

ER/ERL

regulateantherlobeformation

ererl1ererl2erl1erl2erl1erl2/+ererl1erl2(HordandSunetal.,2008)ererl

突變體的花藥藥室中的缺陷

AntherlobedefectsinererlflowersWild-typeererl1erl2ererl1erl2(HordandSunetal.,2008)ER/ERL在藥室形成過程中具有重要作用

ER/ERLplayimportantrolesinlobeformation

MPK3/6在雌雄育性中起著重要作用MAP蛋白激酶

MPK3和

MPK6調(diào)控植物抗病反應(yīng)、胚胎發(fā)育、保衛(wèi)細(xì)胞分化等mpk3

突變體

有正常的育性mpk6-1

突變體育性下降mpk3/+mpk6-1/-

突變體幾乎完全不育MPK3/6

影響雄蕊發(fā)育mpk3mpk6-1mpk3/+mpk6-1/-Wild-type(HordandSunetal.,2008)mpk

突變體的花藥藥室不正常

Wild-typempk3/+mpk6-1/-(HordandSunetal.,2008)正?；ㄋ幇l(fā)育是否需要

細(xì)胞間的聯(lián)系？Iscell-cellcommunicationneededforproperantherdevelopment?藥室細(xì)胞層形成中的問題細(xì)胞間相互作用的機(jī)制是什么？Whatisthemechanismofinteraction?SPL是產(chǎn)生造胞細(xì)胞和絨氈層所必須的

SPLisrequiredfortheformationofsporogenousandtapetalcellsYangetal.,1999花藥細(xì)胞分化是受BAM1和BAM2受體蛋白激酶調(diào)控的BAM1BAM2receptor-likekinasesarerequiredforanthercellfatesstage5bam1bam2WTstage4Hordetal.2006,PlantCellWTbam1bam2bam1bam2突變體表達(dá)減數(shù)分裂基因過廣SDSRAD51Hordetal.2006bam1bam2

花藥表皮下

即是減數(shù)分裂細(xì)胞Wild-typebam1bam2Hordetal.2006關(guān)于BAM1BAM2的小結(jié)1.TheBAM1BAM2

控制表皮下體細(xì)胞的形成2.PMC是花藥中源于L2的細(xì)胞的默認(rèn)細(xì)胞種類3.BAM1和

BAM2是受體蛋白激酶,暗示它們介道細(xì)胞間信號傳導(dǎo)4.SPL

的表達(dá)受到BAM1和BAM2限制5.SPL

則促進(jìn)

BAM1

和

BAM2

的表達(dá)BAM1/BAM2和CLV1進(jìn)化關(guān)系BAM1BAM2BAM3CLV1控制花藥細(xì)胞分化的一個模型Stage6Ems1是絨氈層形成所必須的Stage5Wildtypeems1Zhaoetal.,2002ems1花藥細(xì)胞的減數(shù)分裂Wildtypeems1Zhaoetal.,2002ems1花藥中分子標(biāo)記的性狀Wildtypeems1SDSATA7Zhaoetal.,2002LEUCINERICHREPEATSKINASEDOMAINTRANSMEMBRANEDOMAINEMS1

編碼一個受體蛋白激酶在洋蔥表皮細(xì)胞中瞬間表達(dá)說明EMS1分布在細(xì)胞表面。純化的激酶區(qū)域具有激酶活性。

Zhaoetal.,2002關(guān)于

EMS1的小結(jié)1.EMS1

控制絨氈層的形成

2.減數(shù)分裂中的細(xì)胞核分裂不需要絨氈層

3.EMS1表達(dá)的時空模式是和絨氈層的形成密切相關(guān)的4.EMS1是一個受體蛋白激酶，很可能調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)TPD1可能是EMS1的配體Yangetal.,2003tpd1突變體缺失絨氈層TPD1在減數(shù)分裂

中特異表達(dá)Microsporocytes(Ms)ParietalCell(SPC)SporogenousCell(PSC)PrimaryPrimaryParietalCell(PPC)SecondarySecondaryParietalCell(SPC)Stage4ESPCPSCEndothecium(En)MiddleLayer(ML)Tapetum(T)Stage5EEnMLTMsTPD1+EMS/EXS+SERK1/2胞間信號傳導(dǎo)對絨氈層形成控制Canalesetal.

2002.Curr.Biol.;Zhaoetal.,2002.G&D;Yangetal.2003PlantCell;

Albrechtetal.,2005.PlantCell;Colcombet

etal.,2005.PlantCellEMS1/EXS

和BRI1在序列上很相似EMS1BRI1SERK1/2和

SERK3/BAK1

在進(jìn)化上很接近控制花藥發(fā)育的受體蛋白激酶和其他蛋白1.ER/ERL1/ERL2受體蛋白激酶調(diào)節(jié)花藥發(fā)育過程中藥室的形成

和細(xì)胞分化

(HordandSunetal.,2008).3.BAM1/BAM2受體蛋白激酶和SPL轉(zhuǎn)錄因子控制花藥中體細(xì)胞與生殖細(xì)胞的平衡

(Hordetal.,2006).2.MPK3和

MPK6MAP激酶

調(diào)控

花藥早期細(xì)胞分裂與分化

(HordandSunetal.,2008).5.TheSERK/SERK2受體蛋白激酶也是絨氈層的形成所必須的，可能與EMS1形成復(fù)合受體

(Albrechtetal.,2005;Colcombet

etal.,2005).

4.EMS1受體蛋白激酶是絨氈層的形成所必須的

(Zhaoetal.,2002);TPD1很可能是

EMS1配體

(Yangetal.2003,2005).控制花藥早期發(fā)育的一個模型L1L2L3Stage1EArStage2ER/ERLMPK3/6Stage4EL1L2L3ArchesporialCell(Ar)MeiocytesSPCSporogenous

CellPPCSPCEnMLTapetumStage5EEnMLTMsSPCPSCTPD1-EMS1

-SERK1/2SPLBAM1/2結(jié)論

細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)在花藥早期過程中具有重要作用造孢細(xì)胞是花藥中L2層的默認(rèn)(default)的細(xì)胞種類體細(xì)胞的分化需要胞外的信號減數(shù)分裂的細(xì)胞分裂需要正常的絨氈層功能造孢細(xì)胞和體細(xì)胞的平衡受到正負(fù)反饋機(jī)制的調(diào)控新的問題

花藥發(fā)育過程中信號傳導(dǎo)的下游靶標(biāo)是什么？確定花藥中造孢細(xì)胞的機(jī)制是什么？體細(xì)胞分化的胞外信號是什么？絨氈層影響減數(shù)分裂細(xì)胞分裂是通過何種機(jī)制完成的？造孢細(xì)胞和體細(xì)胞之間的反饋機(jī)制有哪些？致謝楊明，劉德華YoshitakaAzumiHiroyasuOnaka趙大中，楊曉輝LauraZahn陳昌斌，倪為民李武興，王冠芳CareyH.Hord張偉，孫玉金AselaWijeratne肖榮，馮保民權(quán)力，林振國陸平利，蘇釗周筱凡，韓欣偉魯?shù)虾辏瑥埩铖R萱，徐海燕胡宜，田東蘭UeliGrossniklausSteveClarkKeikoTorii張舒群NaomiAltmanRekaAlbertChrisMakaroff李濤王正加StephanSchuster程祝寬董愛武孔宏智王臺楊繼科技部、基金委、復(fù)旦大學(xué);

NSF,DOE,PennState;

RijkZwaan-theNetherlands

葛曉春林娟王應(yīng)祥常芳徐榮艷王子楠黃霽月王英程志號郭長奎朱恩高張佰隆金越崔潔石倩王雙雙尹越尤辰江戚繼楊洪星張寧孫小芬陳雅毛王磊黃梅張亮生曾麗萍王海鋒丁銘李頎王玲王雅瓊謝殊穎劉靜孫荏苒王君賓州州立大學(xué)復(fù)旦大學(xué)合作者雄性發(fā)育的分子遺傳和

進(jìn)化生物學(xué)研究馬紅

hongma@復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

植物科學(xué)研究所

進(jìn)化生物學(xué)研究中心2012年植物分子生物學(xué)暑期班

復(fù)旦大學(xué)內(nèi)容1.花藥早期發(fā)育中的受體蛋白激酶

和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要作用

轉(zhuǎn)錄組研究表明至少有1500個基因在

花藥中特異或比在其他器官有顯著

較高表達(dá)；這些基因是怎么調(diào)控的呢?一種方法是遺傳：尋找突變體，然后分析表型并克隆相應(yīng)的基因。怎么才能找到調(diào)控花藥基因表達(dá)的基因呢？另一種方法分子生物學(xué)：比如篩選一個重要蛋白的相互作用蛋白。還有轉(zhuǎn)錄組測序：了解受調(diào)控基因影響的重要基因。我們找到了一個不育的突變體dyt1野生型dyt1dyt1是完全自交不育的，但用正常花粉授粉可以結(jié)子，

表明雌性育性正常，而雄性則完全不育dyt1突變體雄性不育，可能是因?yàn)榛ǚ郯l(fā)育不正常，也可能是花粉萌發(fā)或以后的缺陷。為了確定dyt1突變體雄性不育的原因，需要進(jìn)一步觀察花粉發(fā)育。我們用了一種叫Alexander的染色，分析dyt1花粉活性。dyt1突變體沒有成熟的花粉我們克隆了DYT1基因，并用功能互補(bǔ)的方法證明這個基因是對的。dyt1突變體為什么沒有成熟的雄性花粉呢？回答這個問題需要用切片方式來分析花藥的早期發(fā)育。觀察發(fā)現(xiàn)在較晚的花藥中，沒有看到不成熟的花粉，連小孢子或四分體都沒有。正常絨氈層分化需要

DYT1

功能dyt1WTstage5Zhangetal.,2006dyt1花藥中減數(shù)分裂細(xì)胞不能形成小孢子，表明減數(shù)分裂需要絨氈層功能DYT1在絨氈層中顯著表達(dá)Zhangetal.,2006絨氈層減數(shù)分裂

細(xì)胞DYT1編碼一個bHLH家族的轉(zhuǎn)錄因子；

所以它很可能調(diào)控絨氈層的基因表達(dá)。

那么它調(diào)節(jié)哪些基因的表達(dá)呢?為了找到更多受DYT1調(diào)控的基因，我們進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，表明有～600個基因在dyt1雄蕊中表達(dá)下調(diào)，還有～300個基因表達(dá)上調(diào)絨氈層基因表達(dá)需要DYT1功能DYT1調(diào)控至少32個編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)DYT1調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)兩個調(diào)控途徑:

DYT1-MYB35/TDF1-AMS-MYB103

DYT1-MS1-MYB99若干已知的轉(zhuǎn)錄因子具有控制絨氈層發(fā)育的功能AGILog2dytlog2wtLog2dyt-wtAnnotationFunctionAt3g284705.18.5-3.4MYB35Pollenformation,upstreamofAMSandMYB103At2g169106.859.39-2.54AMS,bHLHRegulatethetapetumPCD/Preventprematuremicrosporocytesdegeneration.PlantJ.2003At5g561105.257.04-1.79Myb103Callosedissolution,exinformation.PlantJ.2007At5g521705.016.78-1.77ANL1,Unknown;ANSisinvolvedinsynthesisofanthocyaninsinvacuoleAt5g623205.076.65-1.58Myb99ClosetoMyb103,PlantPhysiol.2007At4g349907.288.74-1.45MYB32phenylpropanoidpathway,compositionofpollenwall,plantJ.2004哪些基因是直接受

DYT1調(diào)控的?DYT1能和E盒子在體外結(jié)合6×His-DYT1pMS1-Ebox+++++++0.1ug0.2ug0.5ug1ug3ug6ug_BFreeprobe→從隨即DNA序列中篩選出

DYT1-結(jié)合位點(diǎn)的序列－E盒子ATGMS1E-boxesMS1

是

DYT1的一個靶基因，并帶有E-盒子6×His-DYT1pMS1-EboxA++M1+M2C+L+++Freeprobe→_DYT1可以和MS1啟動子中的

E-盒子相結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明DYT1可以和啟動子在體內(nèi)相結(jié)合

從隨機(jī)寡基序列篩選

DYT1-結(jié)合位點(diǎn)E-box/G-box對稱的DYT1-結(jié)合位點(diǎn)暗示

DYT1以二聚體結(jié)合DNADihongLu,BaominFeng,unpublishedDYT1蛋白是不是個二聚體呢？12978128178207bHLHDYTDYT1有一個bHLH結(jié)構(gòu)域，而這個

家族的其他成員是可以形成二聚體的。但要證明DYT1是個二聚體，還要做實(shí)驗(yàn)，比如酵母雙雜交是一種常用的方法。-AD-DYT1+AD-DYT1BD-DYT1BD-AMSBD-At1g06170BD-At2g31210BD-At2g31220BD-MYB33還有別的蛋白能和DYT1相互作用嗎？候選DTY1-結(jié)合蛋白通過酵母雙雜交篩選,發(fā)現(xiàn)143可能和DYT1結(jié)合的蛋白,

包括13個

bHLHs,4個

MYBs,4個

bZIPs,1個

MADSbox蛋白和5個其他類型的轉(zhuǎn)錄因子.EngaoZhu,YingxiangWang,unpublished檢驗(yàn)體內(nèi)相互作用的實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行中DYT1是怎么和這些蛋白相互作用呢？DYT1的哪些部位

是相互作用需要的？DYT1蛋白的結(jié)構(gòu)與功能會不會是介導(dǎo)蛋白相互作用?DNA結(jié)合DYT區(qū)域的功能是什么?12978128178207bHLHDYT為了驗(yàn)證這個假說，我們用點(diǎn)突變和酵母雙雜的方法來分析DYT1中重要的位點(diǎn)。DYT區(qū)域具有二聚化的功能AD-DYT1AD-AMSAD-ATbHLH89AD-ATvHLH91AD-ATbHLH10AD-ATbHLH57AD-ATbHLH35DBDB-DYT1DB-L84DDB-V129DDB-L131DDB-I134DDB-F139DI141DDB-I143DI144DDB-F152DDB-T153DDB-M156DDB-M159DDB-L162DDB-I178DDB-V202DChenjiangYou,FangChang,unpublished12978128178207bHLHDYT我們想知道DYT1的重要位點(diǎn)在三維結(jié)構(gòu)中的位置可是現(xiàn)在還沒有它的X光衍射三維結(jié)構(gòu)所以我們用計算方法預(yù)測了DYT1可能的三維結(jié)構(gòu)影響蛋白相互作用的突變位置I134DL84DI162DV202DI178DM156DF152DF139DI141DI143DI144D紅色表示已知所有相互作用均消失黃色表示一部分相互作用消失L84DL84D影響與DYT1和AT4g01460的相互作用M156D影響與DYT1、AMS等

多個蛋白的相互作用SPLEMS1/TPD1/SERKDYT1MYB33/653bHLHsPCD,MicrosporesMYB35MYB103AMSMS1MYB99ExineformationMYB32Phenylpropanoid,

lignin,flavonoidsetc.?Completion

ofMeiosisCallosemetabolismEnzymeandOtherproteinotherTFs?Others?一個調(diào)控花藥的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)結(jié)論和問題

絨氈層的分化與功能受到轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的控制

DYT1可能直接調(diào)節(jié)絨氈層基因的轉(zhuǎn)錄，包括

DYT1,M