影響植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的因素

影響植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的因素

自20世紀(jì)80年代以來，轉(zhuǎn)移技術(shù)及其在植物遺傳改良中的應(yīng)用引起了科學(xué)家的興趣。人們嘗試?yán)貌煌D(zhuǎn)化方法對(duì)植物進(jìn)行改良,如基因槍介導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、花粉管通道、電擊穿孔等,培育了抗蟲棉花、抗蟲玉米、抗除草劑大豆、抗除草劑油菜、抗病毒木瓜、延熟番茄、高維生素含量水稻、抗旱小麥等轉(zhuǎn)基因植物新品種和新材料,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上發(fā)揮了重要作用。其中,農(nóng)桿菌介導(dǎo)是比較成熟、應(yīng)用比較廣泛的轉(zhuǎn)化方法。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是一種天然的生物轉(zhuǎn)化體系,自從Zambryski等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功獲得轉(zhuǎn)基因煙草以來,農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化機(jī)理和應(yīng)用逐漸得到人們的關(guān)注。農(nóng)桿菌包括根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes),它們是兩類寄主非常廣泛的土壤細(xì)菌,分別攜帶Ti質(zhì)粒(tumorinducingplasmid)和Ri質(zhì)粒(rootinducingplasmid),兩種質(zhì)粒上都含有一段可轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞內(nèi)的T-DNA(transferDNA),在自然狀態(tài)下通過侵染受傷的植物組織,將T-DNA上的目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞,進(jìn)一步進(jìn)入細(xì)胞核,整合到受體材料的染色體上。其轉(zhuǎn)化具有一定的主動(dòng)性,且具有操作簡單、成本低、轉(zhuǎn)化DNA片段明確、基因拷貝數(shù)低、發(fā)生轉(zhuǎn)基因沉默相對(duì)較少、轉(zhuǎn)移的基因片段較長、轉(zhuǎn)化效率較高等優(yōu)點(diǎn)。但農(nóng)桿菌介導(dǎo)存在受體基因型特異性、組織培養(yǎng)過程容易污染、重復(fù)性不強(qiáng)等問題,在一些植物上的應(yīng)用受到限制。目前,除了大多數(shù)雙子葉植物以外,很多單子葉植物也可以利用農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化。盡管農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的范圍在不斷擴(kuò)大,但傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化在很大程度上依賴組織培養(yǎng)和共培養(yǎng)技術(shù)。事實(shí)上,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化是農(nóng)桿菌菌株與植物細(xì)胞之間相互作用的結(jié)果,包括農(nóng)桿菌附著、Vir誘導(dǎo)、T-DNA加工、T-DNA和相關(guān)Vir蛋白進(jìn)入受體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、T-復(fù)合體在細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)運(yùn)和進(jìn)入細(xì)胞核、T-復(fù)合體卸載包裝、T-DNA整合、T-DNA基因表達(dá)和植株再生等眾多復(fù)雜的步驟。凡是影響農(nóng)桿菌侵染能力、植物細(xì)胞應(yīng)答農(nóng)桿菌侵染能力,以及轉(zhuǎn)化體再生能力的各種因素都將直接影響轉(zhuǎn)化效果。對(duì)一些難轉(zhuǎn)化的植物來說,輔助因素對(duì)轉(zhuǎn)化的成敗及其效率起著至關(guān)重要的作用,這些輔助因素不但可以促進(jìn)農(nóng)桿菌對(duì)受體細(xì)胞的侵染,而且能夠減輕農(nóng)桿菌侵染后導(dǎo)致的植物細(xì)胞褐化死亡現(xiàn)象,促進(jìn)T-DNA的轉(zhuǎn)運(yùn)和向受體基因組上的整合,從而達(dá)到提高植株再生率和轉(zhuǎn)化效率的目的。本文就影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的有關(guān)輔助因素,如抗氧化劑使用、干燥處理、微創(chuàng)傷處理、核基質(zhì)附著序列和表面活性劑使用等方面的研究進(jìn)行了綜述,為進(jìn)一步改進(jìn)農(nóng)桿菌介導(dǎo)難轉(zhuǎn)化植物的遺傳轉(zhuǎn)化效率提供參考。1超聲波輔助農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化技術(shù)農(nóng)桿菌在植物細(xì)胞壁表面的吸附和附著位點(diǎn)是農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的一個(gè)主要步驟是為T-DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞創(chuàng)造一個(gè)合適的條件或環(huán)境。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化過程中進(jìn)行超聲波和負(fù)壓輔助處理有助于提高轉(zhuǎn)化效率,兩種微創(chuàng)傷處理方法的原理都是在外植體的表面產(chǎn)生微傷口,使外源基因容易進(jìn)入。微創(chuàng)傷處理強(qiáng)度太大會(huì)影響植株的再生,太小則達(dá)不到應(yīng)有的效果,均影響轉(zhuǎn)化效率的提高。因此,在研究中需要探索超聲波和負(fù)壓處理的強(qiáng)度、時(shí)間等參數(shù)。超聲波輔助處理對(duì)外植體的傷害主要來自2個(gè)方面,一是超聲波造成外植體損傷,Santarém等利用顯微鏡觀察到經(jīng)過超聲波處理的大豆子葉表面和深層有大量的微小傷口,隨超聲波處理時(shí)間的延長,外植體損傷趨于嚴(yán)重,可能由超聲波的空化效應(yīng)引起,空化作用具有瞬時(shí)性和穩(wěn)定性。在超聲波處理過程中,在液相介質(zhì)里形成許多小氣泡,這些小氣泡達(dá)到一定大小后就會(huì)爆裂,爆裂產(chǎn)生的震動(dòng)波或引起的介質(zhì)快速運(yùn)動(dòng)足以對(duì)細(xì)胞和大分子物質(zhì)造成機(jī)械損傷,因此在組織表層細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上產(chǎn)生許多微小的傷口;二是由于超聲波的熱化作用,超聲在介質(zhì)中傳播時(shí)產(chǎn)生的能量會(huì)使介質(zhì)的溫度升高,從而對(duì)外植體造成傷害。高強(qiáng)度的超聲波可導(dǎo)致細(xì)胞破碎和酶失活,但超聲波處理強(qiáng)度和時(shí)間適宜時(shí),細(xì)胞自身能修復(fù)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的損傷,因而不影響細(xì)胞的生物活性。Trick等首次將超聲波技術(shù)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化中,建立了超聲波輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)(sonication-assistedAgrobarterium-mediatedtransformation,SAAT),即對(duì)在農(nóng)桿菌菌液中的外植體進(jìn)行短時(shí)間的超聲波處理。他們研究了SAAT對(duì)大豆未成熟種子、豇豆嫩葉、玉米未成熟胚、小麥和白云杉種子轉(zhuǎn)化效率的影響,發(fā)現(xiàn)所有供試材料經(jīng)SAAT處理后都顯著提高了GUS瞬時(shí)表達(dá)率,而沒有經(jīng)SAAT處理的對(duì)照材料中GUS瞬時(shí)表達(dá)率則較低。電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),經(jīng)SAAT處理的外植體其細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上存在許多微傷口,而沒有經(jīng)SAAT處理的組織表面仍保持光滑、完整,且隨著SAAT處理時(shí)間延長,傷口由1μm左右增大到1mm左右,這些小傷口足以使農(nóng)桿菌侵入到植物組織內(nèi)部,從而使GUS的平均瞬時(shí)表達(dá)頻率提高了至少100倍。SAAT轉(zhuǎn)化技術(shù)已在大豆、麻類等植物中成功應(yīng)用,提高了轉(zhuǎn)化效率。此外,由于植物組織受到創(chuàng)傷,促使酚類物質(zhì)分泌增加,也促進(jìn)農(nóng)桿菌向植物細(xì)胞的附著,進(jìn)而提高了T-DNA轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞的幾率。Georgiev等用35kHz超聲波處理毛蕊花的葉片,轉(zhuǎn)化效率隨處理時(shí)間不同而變化,處理45s時(shí)轉(zhuǎn)化率最高,60s時(shí)反而觀察到壞死現(xiàn)象,說明超聲處理時(shí)間加長或超聲程度增加對(duì)植物組織產(chǎn)生了破壞作用。目前,超聲波處理是一些植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的主要輔助技術(shù),依據(jù)處理材料的差異,選擇合適的超聲儀器、超聲波頻率、時(shí)間和緩沖液等,能夠刺激新芽的再生,提高農(nóng)桿菌侵染效率及最終的轉(zhuǎn)化效率。但也存在特別的例子,如在小麥幼穗組織的轉(zhuǎn)化中,雖然GUS瞬時(shí)表達(dá)的外植體數(shù)目增多,但平均每個(gè)外植體上GUS表達(dá)的藍(lán)色斑點(diǎn)數(shù)卻減少。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化過程中,改變受體材料所處環(huán)境中外界壓強(qiáng)的負(fù)壓輔助處理,可以明顯提高農(nóng)桿菌對(duì)植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。負(fù)壓處理的原理也是在植物組織表面形成許多微小傷口,同時(shí)促使細(xì)胞分泌一些酚類物質(zhì),從而有利于農(nóng)桿菌吸附,并且激活T-DNA的轉(zhuǎn)移。而且負(fù)壓處理可使農(nóng)桿菌通過細(xì)胞之間的間隙進(jìn)到深層的細(xì)胞組織,從而提高轉(zhuǎn)化效率。但過度的負(fù)壓處理也會(huì)對(duì)細(xì)胞造成傷害,不利于提高轉(zhuǎn)化效果。畢瑞明采用切傷的小麥成熟胚為外植體,在農(nóng)桿菌侵染過程中利用注射器進(jìn)行負(fù)壓處理,證明小麥成熟胚的轉(zhuǎn)化效率得到提高。Mani等將辣椒幼嫩葉片經(jīng)負(fù)壓(400—600mmHg)處理后,GUS瞬時(shí)表達(dá)率增加。水稻、結(jié)縷草、苜蓿、花生、松樹等植物在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程中使用負(fù)壓處理,都不同程度地提高了轉(zhuǎn)化效率。植物組織經(jīng)超聲波處理后再使用抽真空進(jìn)行負(fù)壓處理,可能會(huì)為農(nóng)桿菌進(jìn)入組織提供更多機(jī)會(huì),與共培養(yǎng)只在植物組織表面細(xì)胞的轉(zhuǎn)化相比,可使農(nóng)桿菌在植物組織內(nèi)部進(jìn)行轉(zhuǎn)化。Sailaja等用香蕉氣生根為材料,研究了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程中超聲波與負(fù)壓方法結(jié)合處理對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響,結(jié)果表明,6min超聲波處理,結(jié)合6min負(fù)壓處理,GUS瞬間表達(dá)率高達(dá)39.4%,處理時(shí)間繼續(xù)延長不僅沒有提高GUS表達(dá)率,反而不利于抗性再生植株的獲得。deOliveira等以柑橘上胚軸莖段為材料進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化,發(fā)現(xiàn)對(duì)受體材料進(jìn)行2s超聲處理后再進(jìn)行10min抽真空處理,與不處理對(duì)照及各自分別處理相比,GUS瞬時(shí)表達(dá)率顯著提高,該結(jié)果與在四季豆中獲得的結(jié)果相似,表明2種創(chuàng)傷處理結(jié)合對(duì)提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的效果更加明顯,但其作用程度在不同植物和基因型間存在差異。2抗氧化酶系統(tǒng)過氧化氫(H2O2)、羥自由基(·OH)和超氧自由基(O2-)等活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)是植物細(xì)胞發(fā)生氧化反應(yīng)的副產(chǎn)物,影響細(xì)胞正常的新陳代謝及生長發(fā)育,這種影響對(duì)植物細(xì)胞的再生過程具有雙重作用,一方面,氧化脅迫引發(fā)植物體內(nèi)相關(guān)的抗氧化酶類的合成,促進(jìn)植株再生;另一方面,發(fā)生氧化脅迫的細(xì)胞其細(xì)胞膜通透性改變,進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞功能的紊亂,甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng),包括各種抗氧化劑酶類,如過氧化物酶(peroxidase,POD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbateperoxidase,APX)等,能夠抑制ROS的產(chǎn)生。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化過程中,農(nóng)桿菌侵染即對(duì)植物細(xì)胞施加了逆境,植物細(xì)胞容易產(chǎn)生過氧化物,導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化脅迫,影響植物組織存活和再生。同時(shí),ROS也影響農(nóng)桿菌的生長,進(jìn)而阻止農(nóng)桿菌對(duì)植物組織的侵染。過氧化物的積累引起細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中POD和CAT等酶類活性增強(qiáng),以抑制氧化反應(yīng)的加劇。在被農(nóng)桿菌侵染的小麥組織中,顯微鏡下可觀察到明顯的細(xì)胞褐化死亡現(xiàn)象,嚴(yán)重影響了外源基因向小麥中的轉(zhuǎn)化。研究表明,培養(yǎng)基中添加一些抗氧化劑,如硝酸銀(AgNO3)、半胱氨酸(cysteine,Cys)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)、抗壞血酸(vitamineC,Vc)、甘氨酸甜菜堿(glycinebetaine,GB)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)和硫辛酸(lipoicacid,LA)等,作為非酶類去除活性氧的清除劑,能夠延遲或阻止蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物及DNA的氧化,使細(xì)胞免受進(jìn)一步傷害,減少植物組織褐化和死亡,有利于植物組織農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后的再生。AgNO3是一種強(qiáng)還原劑,有助于減輕農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程中植物細(xì)胞內(nèi)部的氧化反應(yīng),阻止植物細(xì)胞褐化死亡。王秀紅等比較了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米所用培養(yǎng)基中添加不同濃度AgNO3對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及愈傷組織質(zhì)量的影響,表明AgNO3能減緩細(xì)胞中褐變物質(zhì)的分泌,使培養(yǎng)基保持透明,5mg·L-1AgNO3對(duì)誘導(dǎo)胚性愈傷組織及改善愈傷組織質(zhì)量的效果最好,對(duì)提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米的效率具有積極作用。但趙東等在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化茶樹葉片的試驗(yàn)中卻得到了相反結(jié)果,共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加AgNO3的濃度與GUS瞬間表達(dá)率成反比,認(rèn)為可能是由于過量銀離子對(duì)農(nóng)桿菌產(chǎn)生了毒害作用,抑制了農(nóng)桿菌的生長和侵染。Packer等發(fā)現(xiàn),LA作為一種參與幾個(gè)多酶復(fù)合體的含硫物質(zhì),能防止細(xì)胞中的代謝物質(zhì)被氧化產(chǎn)生酚類物質(zhì),降低組織壞死程度。LA比較容易通過滲透穿過細(xì)胞壁,改進(jìn)植物組織被農(nóng)桿菌侵染后轉(zhuǎn)化細(xì)胞的存活率和再生率,從而顯著提高一些轉(zhuǎn)化比較頑固的植物,如小麥、大豆、棉花等的轉(zhuǎn)化效率,但不同植物L(fēng)A適宜用量和效果不同。在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥、大豆和番茄的培養(yǎng)基中,LA的適宜濃度分別為50、250和10μmol·L-1,小麥轉(zhuǎn)化率從2.8%提高到5.7%,大豆轉(zhuǎn)化率從0.6%提高到3.7%,番茄轉(zhuǎn)化率從29.8%提高到87.0%。GB和GSH能保護(hù)植物的芽器官免受非生物脅迫。GB能維持細(xì)胞膜的完整性,外源GB能提高細(xì)胞抗脅迫能力。GSH是許多氧化還原反應(yīng)中的有效因子,其作用是作為細(xì)胞的保護(hù)劑及促進(jìn)細(xì)胞分裂。PVP能防止組織褐化,培養(yǎng)基中添加PVP可減輕植物組織褐化程度,Figueiredo等證實(shí)PVP能聚集受傷組織中產(chǎn)生的酚類物質(zhì)。Dutt等研究了LA、PVP、GSH、GB對(duì)檸檬農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的影響,表明在分化培養(yǎng)基中加入50μmol·L-1LA能顯著提高轉(zhuǎn)化率(比對(duì)照提高約4倍),GB的作用適中,GSH和PVP對(duì)轉(zhuǎn)化效果影響不明顯,但隨著抗氧化劑濃度的增加,轉(zhuǎn)化率有所下降,可能是由于高濃度的抗氧化劑影響了電子傳遞系統(tǒng),破壞了能量代謝或分配。吳珊等將AgNO3和PVP一起用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化茶樹葉片培養(yǎng)基中,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化效率提高。Cys也具有抑制植物組織褐變的作用,在共培養(yǎng)基中添加Cys能顯著提高佛手抗性愈傷組織誘導(dǎo)率。Olhoft等在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆子葉的培養(yǎng)基中添加了硫代硫酸鈉、Cys和DTT,提高了GUS的轉(zhuǎn)化效率。汲逢源等在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆下胚軸的培養(yǎng)基中加入了硫代硫酸鈉、Cys和DTT,降低了外植體的褐化和死亡,大幅度提高了GUS瞬時(shí)表達(dá)效率。Liu等研究了Cys對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆效率的影響,發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入600mg·L-1Cys對(duì)改進(jìn)大豆轉(zhuǎn)化效率的作用最好。在小麥農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方面,于惠敏等以小麥胚性愈傷組織為受體材料,研究了DTT和PVP對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響,發(fā)現(xiàn)在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加DTT0.10%—0.15%、PVP1.00%時(shí)的作用最為明顯,且DTT的效果優(yōu)于PVP。Enríquez-Obregón等發(fā)現(xiàn),在甘蔗莖節(jié)的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加15mg·L-1Vc、40mg·L-1Cys、2mg·L-1AgNO3,對(duì)提高轉(zhuǎn)化效率具有較好的作用。綜上所述,在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物組織的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基或共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入合適種類和濃度的抗氧化劑能夠減少植物組織褐化,提高轉(zhuǎn)化效率。3間相互作用的全方位調(diào)節(jié)在表達(dá)載體上插入與T-DNA在植物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運(yùn)和整合有關(guān)的序列或基因,對(duì)提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的效率具有潛在作用。其中,核基質(zhì)附著序列(matrixattachmentregions,MAR;scaffoldattachmentregions,SAR)最受關(guān)注,目前已從酵母、植物、動(dòng)物中分離出了多個(gè)MAR。MAR序列位于轉(zhuǎn)錄活躍的DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)域的邊界,參與染色質(zhì)的活動(dòng),調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu),通過本身具有的分割作用使每個(gè)轉(zhuǎn)錄單元保持相對(duì)的獨(dú)立性,免受周圍染色質(zhì)的影響,可能與細(xì)胞核穩(wěn)定性有關(guān)。另外,MAR結(jié)合蛋白與核小體結(jié)合的組蛋白競爭,使染色體打開,有助于基因的表達(dá)。MAR也可能會(huì)影響到DNA的重組。MAR序列中有一段富含AT的區(qū)域,稱為BURs(base-unpairingregions),能夠降低由超螺旋引起的負(fù)面影響,此外還含有A-boxes、T-boxes、解旋位點(diǎn)等元件。研究發(fā)現(xiàn),并不是所有的MAR對(duì)基因表達(dá)起正調(diào)節(jié)作用,有的反而降低基因的表達(dá)。許多因素對(duì)MAR的作用產(chǎn)生影響,如當(dāng)DNA解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶結(jié)合到MAR的特定區(qū)域時(shí),能夠使DNA雙鏈打開形成單鏈,破壞MAR的功能;臨近的啟動(dòng)子和RNA聚合酶與MAR間的相互作用能增強(qiáng)基因的表達(dá)等。最近,Zhang等從煙草中分離到一個(gè)新的MAR,命名為TM2,發(fā)現(xiàn)TM2中含有與DNA動(dòng)態(tài)變化相關(guān)的元件,同時(shí)受多種元件的協(xié)同調(diào)節(jié),TM2還能調(diào)節(jié)核小體打開,其功能的實(shí)現(xiàn)有賴于目的基因的本底表達(dá)能力,證明TM2能夠提高外源目標(biāo)基因在水稻和煙草中的表達(dá)水平。將TM2分別添加到GUS完整表達(dá)框兩側(cè),利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草葉片,發(fā)現(xiàn)GUS表達(dá)增強(qiáng),且減少了轉(zhuǎn)基因的沉默現(xiàn)象,TM2串聯(lián)重復(fù)添加到GUS表達(dá)框兩側(cè)時(shí),GUS表達(dá)進(jìn)一步提高,但在煙草愈傷組織中的效果不如葉片明顯,可能是細(xì)胞生長狀態(tài)影響了MAR作用。在GUS表達(dá)框一側(cè)添加反向TM2情況下,與對(duì)照載體相比GUS表達(dá)同樣提高,且啟動(dòng)子上游添加效果優(yōu)于終止子下游,說明TM2是一個(gè)雙向調(diào)節(jié)元件,5′-MAR比3′-MAR效果更好。TM2不但可以增強(qiáng)外源目標(biāo)基因在受體植物中的表達(dá)水平,而且能夠提高轉(zhuǎn)化效率。利用啟動(dòng)子上游和終止子下游均含有TM2的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化水稻和煙草,水稻的轉(zhuǎn)化效率比對(duì)照載體提高了1.5倍,煙草的轉(zhuǎn)化效率比對(duì)照提高了1.7—2.1倍,轉(zhuǎn)化效率的提高可能是由于TM2增強(qiáng)了載體上nptⅡ篩選標(biāo)記基因的表達(dá)水平,提高了轉(zhuǎn)基因植株的篩選效果。但在將adh1轉(zhuǎn)化玉米的研究中發(fā)現(xiàn),將MAR序列構(gòu)建到adh1上游才能發(fā)揮作用,在chn50轉(zhuǎn)化煙草的試驗(yàn)中也存在類似情況。Han等將來自煙草的MAR序列連接到含GUS的雙元表達(dá)載體上,利用農(nóng)桿菌分別轉(zhuǎn)化煙草和白楊,發(fā)現(xiàn)GUS表達(dá)水平在白楊中提高了近10倍,在煙草中提高了2倍,也提高了白楊再生芽抗卡那霉素篩選劑的能力。此外,在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化中,也有利用MAR提高轉(zhuǎn)化效率的類似報(bào)道。為了提高外源DNA進(jìn)入植物細(xì)胞后的穩(wěn)定性和向基因組中整合的效率,在目標(biāo)基因表達(dá)框兩側(cè)添加MAR序列是一種行之有效的策略。農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的過程,涉及一系列在農(nóng)桿菌染色體上或質(zhì)粒上存在的與附著到植物細(xì)胞表面和T-DNA轉(zhuǎn)移相關(guān)的Vir毒性基因。研究表明,Vir表達(dá)受到植物信號(hào)分子如乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)等酚類化合物的誘導(dǎo)。其中,VirA是結(jié)合在農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)膜上的受體蛋白,能對(duì)植物產(chǎn)生的酚類物質(zhì)產(chǎn)生感應(yīng),包含一段C端胞質(zhì)域,有自激酶的功能,可在組氨酸殘基上發(fā)生自磷酸化,這種發(fā)生了磷酸化的VirA蛋白可將其磷酸基轉(zhuǎn)移給VirG蛋白,使ViG蛋白活化。VirG蛋白也稱為DNA結(jié)合活化蛋白,具有激活其它Vir轉(zhuǎn)錄的作用。VirB幫助T-DNA轉(zhuǎn)運(yùn)并提供能量。VirD決定內(nèi)切酶的活性,與T-DNA復(fù)合體的形成和加工相關(guān)。VirC負(fù)責(zé)對(duì)T-DNA邊界序列缺口的剪切,當(dāng)VirD表達(dá)不足時(shí),VirC也可對(duì)T-DNA進(jìn)行加工。Lu等最近發(fā)現(xiàn),VirC2蛋白C端第82—202位氨基酸鏈能夠形成一個(gè)Ribbon-helix-helix(RHH)DNA結(jié)合區(qū),該區(qū)域發(fā)生變化時(shí)嚴(yán)重影響T-DNA與VirC2的結(jié)合,降低T-DNA在植物中的轉(zhuǎn)化效率。VirE在T-DNA轉(zhuǎn)移過程中保護(hù)其免受核酸酶的降解,VirD2和VirE2與T-復(fù)合體的形成及轉(zhuǎn)移有關(guān)。在植物中已鑒定出與農(nóng)桿菌VirE2蛋白互作的蛋白VIP1(VirE2-interactingprotein1),其不與VirD2蛋白互作,發(fā)現(xiàn)VirE2蛋白進(jìn)入植物細(xì)胞受VIP1共表達(dá)的誘導(dǎo),后者進(jìn)一步幫助T-DNA復(fù)合體從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核,以及向染色體上的整合,與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物密切相關(guān),并從擬南芥中克隆了VIP1。Anand等應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù),在擬南芥中鑒定出與VirE2互作的另一個(gè)蛋白VIP2,該蛋白含有一個(gè)NOT結(jié)構(gòu)域,體外試驗(yàn)證明VIP2與VIP1相互作用,轉(zhuǎn)錄分析證明VIP2具調(diào)節(jié)子的功能。Wu等利用含額外拷貝VirG、VirB、VirC的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化硬粒小麥新鮮幼胚,轉(zhuǎn)化率0.6%—9.7%,利用含輔助質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化普通小麥,轉(zhuǎn)化率為0.3%—9.0%,表明農(nóng)桿菌中Vir過表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)化植物的效果。類似的試驗(yàn)中,用含有額外Vir載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化火炬松成熟胚,GUS瞬時(shí)表達(dá)率高達(dá)92.8%。Hansen等利用含VirG發(fā)生突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草葉片和玉米嫩芽,提高了GUS轉(zhuǎn)化率,證明農(nóng)桿菌中毒性基因的突變促進(jìn)了轉(zhuǎn)化。Tzfira等首先將來源于擬南芥中VIP1的反義基因轉(zhuǎn)入煙草,利用含反義VIP1的煙草植株重復(fù)轉(zhuǎn)化GUS,發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌不能侵染含反義VIP1的煙草葉片,阻止了癭瘤形成;T-DNA表達(dá)的早期階段被阻斷,VirE2蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的積累急劇降低,沒有GUS表達(dá),轉(zhuǎn)化率顯著下降。進(jìn)一步將過表達(dá)擬南芥VIP1的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入煙草,利用過表達(dá)VIP1的煙草植株重復(fù)轉(zhuǎn)化GUS,發(fā)現(xiàn)GUS表達(dá)率和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率與對(duì)照相比顯著提高,證實(shí)VIP1確實(shí)具有促進(jìn)T-DNA轉(zhuǎn)運(yùn)和提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的作用。同樣,將煙草中的VIP2沉默或使擬南芥中的VIP2突變(Atvip2),農(nóng)桿菌侵染煙草和擬南芥后T-DNA的轉(zhuǎn)化效率大大降低,說明VIP2是T-DNA在植物細(xì)胞中穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運(yùn)和整合必需的因子。4農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的金屬酶系統(tǒng)轉(zhuǎn)化反應(yīng)表面活性劑是數(shù)目眾多的一類化合物,有天然的表面活性劑,也有人工合成的表面活性劑,在農(nóng)藥、化工、印刷、紡織、食品等方面應(yīng)用廣泛。表面活性劑可以作為一種滲透劑,使植物細(xì)胞質(zhì)膜變得敏感,溶質(zhì)較易進(jìn)入。表面活性劑可以分為陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑和非離子表面活性劑四大類。由于非離子表面活性劑對(duì)植物來說毒性最低,因此在生物研究中應(yīng)用比較普遍。表面活性劑有2個(gè)主要特征:一是表面活性劑分子具有雙親結(jié)構(gòu),對(duì)有機(jī)物具有強(qiáng)的親和力;二是表面活性劑分子在較低濃度下就能吸附在兩相界面上,明顯降低界面張力,使高分散系統(tǒng)趨于穩(wěn)定。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化中,表面活性劑可以通過減小表面張力增加農(nóng)桿菌在受體細(xì)胞上的吸附,而且可以通過其對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響提高T-DNA的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。Clough等在研究擬南芥植株水平蘸花轉(zhuǎn)化法的影響中,發(fā)現(xiàn)Silwet-77表面活性劑明顯提高了轉(zhuǎn)化效率,農(nóng)桿菌侵染液中加入0.005%—0.1%Silwet-77的轉(zhuǎn)化效果高于抽真空處理,但濃度再高則引起組織壞死,認(rèn)為合適的濃度為0.05%。Curtis等研究了不同種類和濃度表面活性劑對(duì)利用農(nóng)桿菌蘸花法轉(zhuǎn)化蘿卜效果的影響,認(rèn)為菌液中加入0.05%Silwet-77時(shí)轉(zhuǎn)化效果最好,PluronicF-68和Tween20相比對(duì)照也都提高了轉(zhuǎn)化效率。Cheng等在利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法首次獲得轉(zhuǎn)基因小麥的研究中,證明共培養(yǎng)液中添加適當(dāng)濃度Silwet和PluronicF-68對(duì)農(nóng)桿菌侵染和T-DNA進(jìn)入小麥細(xì)胞具有積極作用。Tween20和TritonX即使很低的濃度對(duì)小麥幼胚愈傷組織也有傷害。然而,Chhabra等發(fā)現(xiàn),農(nóng)桿菌侵染液中加入0.2%Tween20能提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥愈傷組織的效率,但濃度大于0.2%時(shí)GUS瞬時(shí)表達(dá)率急劇下降。Wu等分析了共培養(yǎng)液中不同濃度Silwet-77對(duì)小麥幼胚存活率、愈傷組織誘導(dǎo)率及GUS表達(dá)率的影響,發(fā)現(xiàn)隨著Silwet-77濃度的增加GUS表達(dá)率提高,但濃度大于0.06%時(shí)所有幼胚死亡,認(rèn)為Silwet-77用量0.01%比較適合農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化小麥幼胚。Kim等研究了TritonX100、Tween20和SilwetL-77對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥離體葉片效果的影響,發(fā)現(xiàn)菌液中3種表面活性劑的濃度0.01%左右時(shí),GUS的表達(dá)率顯著提高,其中加入0.01%TritonX100或Tween20時(shí)GUS表達(dá)率提高約1.6倍,但濃度高于0.05%引起葉片萎蔫,嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)化效果。Liu等對(duì)影響大豆子葉節(jié)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的因素進(jìn)行了研究,表明共培養(yǎng)液中SilwetL-77的適宜濃度為0.02%,配合添加600mg·L-1Cys并在22℃條件下進(jìn)行侵染,之后采用合理的篩選步驟,轉(zhuǎn)化效率提高到3.8%—11.7%。Yang等對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米幼胚愈傷組織的技術(shù)體系進(jìn)行了優(yōu)化,確定菌液中含有0.01%—0.02%SilwetL-77最適合玉米幼胚的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。Suzuki等在麝香蘭胚轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中加入了0.1%Tween20,發(fā)現(xiàn)GUS表達(dá)率明顯提高。因此,在農(nóng)桿菌侵染液中添加適宜濃度的表面活性劑對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物是有益的。但在受體材料預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中使用表面活性劑,試圖通過改變外植體侵染前的生理狀態(tài)以提高外源基因轉(zhuǎn)化率的有效性,還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。5小麥胚性愈傷組織/受害者組織間的相互作用受體組織的狀態(tài)將影響其農(nóng)桿菌侵染后的存活和再生能力,適當(dāng)?shù)母稍锾幚砜纱偈怪参锝M織失水,提高滲透勢,刺激分裂,使隨后產(chǎn)生的愈傷組織生長旺盛、分化能力增強(qiáng)。在利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大多數(shù)植物的程序中都包括在濾紙上吸去外植體表面液體的步驟,即進(jìn)行干燥處理。延長干燥處理的時(shí)間,變化干燥處理的方式,并在共培養(yǎng)階段對(duì)植物組織和農(nóng)桿菌進(jìn)行干燥處理,對(duì)提高再生率和轉(zhuǎn)化率都有作用。但干燥時(shí)間過長,細(xì)胞過度失水,愈傷組織不能恢復(fù)生長而導(dǎo)致死亡;干燥時(shí)間過短,愈傷組織僅失去表層水分,達(dá)不到風(fēng)干細(xì)胞和提高轉(zhuǎn)化的效果。農(nóng)桿菌侵染前后對(duì)外植體進(jìn)行干燥處理其再生和轉(zhuǎn)化效果不同。Polin等采取不同干燥處理方法,研究了干燥處理對(duì)美洲栗幼胚農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的影響,將經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后的幼胚均勻擺放到無菌濾紙上逐漸干燥或?qū)⒂着咴诔瑑襞_(tái)內(nèi)風(fēng)吹干燥,發(fā)現(xiàn)干燥處理能顯著提高綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)的表達(dá)率。Zhang等將農(nóng)桿菌侵染后的美洲栗胚性組織在濾紙上干燥處理2d,將對(duì)真菌具有抗性的小麥草酸氧化酶基因轉(zhuǎn)入了美洲栗,轉(zhuǎn)化率得到提高,認(rèn)為共培養(yǎng)條件是提高轉(zhuǎn)化效率的重要因素。Cheng等首次將小麥幼胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)采用了僅在濾紙上進(jìn)行的方式,研究了干燥濾紙上添加0—500μL無菌水對(duì)GUS表達(dá)、愈傷組織生長和農(nóng)桿菌生長的影響,發(fā)現(xiàn)200μL以下用量的無菌水顯著提高了GUS表達(dá)率,50μL時(shí)效果最好(每個(gè)外植體的藍(lán)色斑點(diǎn)數(shù)為139.3,對(duì)照為33.9)。干燥共培養(yǎng)處理不僅促進(jìn)了T-DNA轉(zhuǎn)移,而且促進(jìn)了細(xì)胞的恢復(fù)生長,共培養(yǎng)后100%的幼胚都能存活并快速生長,而對(duì)照處理只有60%—80%的存活率,且恢復(fù)生長較慢。另外,干燥共培養(yǎng)處理顯著抑制了農(nóng)桿菌過度生長,農(nóng)桿菌數(shù)目比對(duì)照降低了約3倍。最終,干燥處理顯著提高了小麥幼胚轉(zhuǎn)化效率,比對(duì)照提高7倍左右(干燥處理為12.4%,對(duì)照為1.6%)。該研究還證明,受體材料高滲透壓處理、脫落酸(abscisicacid,ABA)處理和侵染前干燥處理均不能達(dá)到共培養(yǎng)期間干燥處理顯著提高轉(zhuǎn)化效率的效果。但另外的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),小麥胚性愈傷組織在農(nóng)桿菌侵染前進(jìn)行30min的干燥處理,抗性愈傷組織獲得率明顯提高,干燥處理時(shí)間過長則效果相反,說明農(nóng)桿菌侵染前對(duì)受體組織進(jìn)行適當(dāng)時(shí)間的干燥處理也有利于提高轉(zhuǎn)化效率。Ding等將農(nóng)桿菌侵染后的小麥成熟胚愈傷組織在濾紙上干燥共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌生長受到抑制,不但提高了T-DNA的轉(zhuǎn)運(yùn),而且促進(jìn)了愈傷組織分化。丁莉萍等將小麥成熟胚愈傷組織在濾紙上與農(nóng)桿菌共培養(yǎng),GUS瞬時(shí)表達(dá)率達(dá)90%,證實(shí)干燥共培養(yǎng)的愈傷組織含菌量少,有利于后續(xù)培養(yǎng)階段對(duì)農(nóng)桿菌的控制和受體組織的再生,提高轉(zhuǎn)化效率。甘蔗外植體被農(nóng)桿菌侵染前在超凈臺(tái)中風(fēng)15—60min,然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化,發(fā)現(xiàn)GUS轉(zhuǎn)化率提高,干燥處理30min效果最好,超過60min將對(duì)外植體造成不可逆的傷害。水稻成熟胚愈傷組織在農(nóng)桿菌侵染前風(fēng)干處理10—15min得到了相似結(jié)果,轉(zhuǎn)化率至少提高了10倍。李笑寒等通過在培養(yǎng)基上鋪墊濾紙方式對(duì)水稻愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)階段進(jìn)行干燥處理,發(fā)現(xiàn)由于降低了共培養(yǎng)環(huán)境中的水分含量,增加了農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞間的接觸,抑制農(nóng)桿菌生長,提高了轉(zhuǎn)化率。Chaudhary等將棉花胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到無篩選劑的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)30—40d,在此培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基會(huì)逐漸干燥,相當(dāng)于對(duì)外植體進(jìn)行了緩慢的干燥處理,再將經(jīng)干燥處理的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上,重復(fù)此步驟直到出現(xiàn)再生芽,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化率大大提高。在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化荔枝的研究中,曾黎輝等對(duì)荔枝胚性愈傷組織在轉(zhuǎn)化前進(jìn)行干燥預(yù)處理,發(fā)現(xiàn)由于吸去了組織表面的水分,有利于菌液充分進(jìn)入細(xì)胞間隙,對(duì)提高荔枝轉(zhuǎn)化效率有一定促進(jìn)作用。6其它影響農(nóng)桿菌誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的因素盡管許多植物利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得了成功,但對(duì)大多數(shù)植物來說轉(zhuǎn)化效率依舊很低,亟待建立高效的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng),以便加速利用基因工程途徑對(duì)植物進(jìn)行遺傳修飾的步伐。目前為止,雖然對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的影響因素進(jìn)行了大量研究,但很多結(jié)果缺乏重復(fù)性,如本課題在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥幼胚和成熟胚的培養(yǎng)基中加入抗氧化劑和表面活性劑等并沒有取得預(yù)期效果,超聲波處理促進(jìn)農(nóng)桿菌侵染小麥幼胚和成熟胚的效果也并不明顯(資料未發(fā)表)。至于受體植物材料在農(nóng)桿菌侵染前、共培養(yǎng)階段和侵染后進(jìn)行干燥處理后均能提高不同植物轉(zhuǎn)化效率的解釋,多數(shù)研究認(rèn)為干燥處理抑制了農(nóng)桿菌的過度生長,引起植物細(xì)胞發(fā)生了輕微質(zhì)壁分離,促進(jìn)了T-DNA轉(zhuǎn)入和植物細(xì)胞恢復(fù)生長,但干燥處理提高轉(zhuǎn)化效率的機(jī)理仍不清楚,有待深入探討。另外需要指出的是,在一種植物或外植體上取得的結(jié)果往往不能在其它植物或外植體上普遍應(yīng)用,需要根據(jù)不同植物、基因型和外植體類型,進(jìn)一步優(yōu)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的影響因素,尤其是共培養(yǎng)階段的輔助處理技術(shù)。共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加AS被認(rèn)為是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物取得突破的關(guān)鍵,但抗氧化劑使用、表面活性劑使用和干燥處理也是不容忽視的環(huán)節(jié)。對(duì)于一些轉(zhuǎn)化非常困難的植物,可能需要綜合運(yùn)用微創(chuàng)傷、干燥、抗氧化劑和表面活性劑等處理,優(yōu)化試驗(yàn)方案。除了前面所述的影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的輔助因素之外,近幾年對(duì)影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的其它因素進(jìn)行了探討。Khanna等利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥幼胚后,發(fā)現(xiàn)在分化培養(yǎng)基中添加0.1mol·L-1亞精胺后促進(jìn)了抗性愈傷組織生長和植株再生,轉(zhuǎn)化率提高了2倍以上。Boyko等在擬南芥和煙草的轉(zhuǎn)化中證明,將MS培養(yǎng)基中的硝酸銨用量增加2—3倍,明顯促進(jìn)了T-DNA向受體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化和向染色體上的重組,轉(zhuǎn)化率提高3倍左右,認(rèn)為高濃度硝酸銨的存在有利于增強(qiáng)T-DNA在轉(zhuǎn)移過程中的完整性。進(jìn)一步研究了氯化鉀和稀土元素對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥和煙草的影響,