用差速離心法制備油菜種子微粒體及微粒體蛋白濃度測(cè)定

用差速離心法制備油菜種子微粒體及微粒體蛋白濃度測(cè)定

油菜是中國(guó)的重要油食動(dòng)物之一。含油量和脂肪酸的組成是關(guān)系到油味素質(zhì)量?jī)?yōu)良的重要指標(biāo)之一。由于多不飽和脂肪酸如亞油酸(18∶2)、亞麻酸(18∶3)等易氧化的缺點(diǎn),人們希望提高油菜單不飽和酸如油酸(18∶1)的含量。在亞油酸和亞麻酸的合成過(guò)程中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Δ12-脂肪酸去飽和酶(FAD2酶)的活性尤為重要,因?yàn)樗?fù)責(zé)向位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的單不飽和脂肪酸中引入第2個(gè)雙鍵,是多不飽和脂肪酸合成的第一步也是關(guān)鍵的一步。它存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上,微粒體是在制備真核細(xì)胞勻漿時(shí)形成的囊泡微粒,由破碎的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成。因此,油菜種子微粒體的制備是對(duì)油酸脫氫酶進(jìn)行深入研究的前提。目前,微粒體的研究范圍多集中于哺乳動(dòng)物(人、大鼠和小鼠),油菜種子微粒體制備方法的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者采用差速離心法制備油菜種子微粒體,并對(duì)其蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè),以期為油菜種子油酸脫氫酶的深入研究奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1高油酸油酸鹽系表面活性劑油菜種子于2009年10月在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所科研基地進(jìn)行播種,于2010年4月對(duì)高油酸、低油酸2個(gè)品系進(jìn)行人工授粉,掛牌標(biāo)記,在授粉后47d進(jìn)行取樣。取樣時(shí)快速剪下角果,置于50ml帶塞離心管中,馬上投入液氮罐,帶回實(shí)驗(yàn)室后迅速置于-70℃超低溫冰箱保存。1.2儀器、試劑和試藥AR2140電子分析天平(OHAUS,USA);高速離心機(jī)(Beckman,Germany);Ultra-turraxT8組織勻漿機(jī)(IKA,Germany);8453紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(Agilent,USA);超低溫冰箱(-80℃);超速離心機(jī)(Beckman,Germany);pH計(jì);真空干燥箱;超聲波清洗機(jī);制冰機(jī);牛血清蛋白(Sigma公司);Tris緩沖液、EDTA、DTT、HEPES、硫酸鎂、乙醇、蔗糖、鹽酸、磷酸、考馬斯亮藍(lán)、山梨醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。所用試劑溶液均按照文獻(xiàn)方法配制。1.3設(shè)備剪刀、燒杯、量筒等常用器具。1.4優(yōu)先處理和微粒準(zhǔn)備1.4.1山梨醇提取液hepesi將油菜角果從超低溫冰箱中取出,立即迅速去掉角果,將約3g種子剝出,精確稱量其重量,放入研缽中,加入分離提取緩沖液HEPES(pH7.2,包含50mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸、0.6mol/L山梨醇,40mmol/L抗壞血酸鈉、1mmol/LNa2EDTA,1mmol/LMgSO4,配制過(guò)程在4℃進(jìn)行)4℃研缽(預(yù)冷)中充分研磨,直到每粒種子的種皮脫落為止。1.4.2沉淀-過(guò)渡系統(tǒng)棄去上清液后,加入緩沖液,在冰浴中勻漿20s,重復(fù)2次。將勻漿液轉(zhuǎn)移至具塞離心管中,以10000×g離心10min,得到上清液,再轉(zhuǎn)入新離心管中,于100000×g超速離心60min(4℃),棄去上清液,得到沉淀。沉淀用Tris-HCl緩沖液(pH7.6,包含Tris-HCl50mmol/L,Na2EDTA1mmol/L,二硫蘇糖醇1mmol/L)重新懸浮。分裝后,于-70℃凍存。1.5測(cè)定了油種子總蛋白的含量1.5.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制①標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的配制:精確稱取牛血清白蛋白5mg,用蒸餾水定容至10ml,配成500μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。②考馬斯亮藍(lán)G-250溶液的配制:精確稱取考馬斯亮藍(lán)G-250100mg,溶于50ml95%乙醇,再加入120ml85%磷酸溶液,稀釋定容至1000ml備用。1.5.2測(cè)波長(zhǎng)的確定在試管中分別精確移取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35和0.40ml,加蒸餾水稀釋至0.4ml,然后在各試管中分別加入4.0ml考馬斯亮藍(lán)G-250溶液,搖勻,室溫下反應(yīng)5min,在595nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.5.3精密度、準(zhǔn)確度配制高、中、低3種濃度(500、250、125μg/ml)牛血清白蛋白溶液,1d內(nèi)每個(gè)濃度測(cè)定5個(gè)時(shí)間點(diǎn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)濃度測(cè)定吸收度3次,計(jì)算日內(nèi)精密度;連續(xù)5d每個(gè)濃度每天測(cè)定吸收度3次,計(jì)算日間精密度。1.5.4蛋白濃度的測(cè)定分別取上述1.4.2制備的勻漿樣品,高油酸材料與低油酸材料各2份,每份20μl,加水稀釋至0.4ml,然后加入4.0ml考馬斯亮藍(lán)G-250溶液,搖勻,室溫下反應(yīng)5min后進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定,測(cè)定樣品吸光度,代入其回歸方程中,計(jì)算油菜種子微粒體中蛋白濃度。2結(jié)果與分析2.1線性關(guān)系考察由圖1可知,牛血清白蛋白濃度與吸收度在0～500μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,其回歸方程為:Y=0.00134X+0.064(r=0.9963)。2.2表1顯示了精密度測(cè)試的結(jié)果，它們可以滿足生物樣品分析的要求2.3低油酸材料種子微粒體的蛋白濃度高油酸材料種子微粒體的蛋白濃度為405.7μg/ml,而低油酸材料種子微粒體的蛋白濃度僅為335.1μg/ml。由此可見(jiàn),由表2可知,高油酸材料發(fā)育過(guò)程中相同質(zhì)量的種子提取出的微粒體蛋白平均含量要高于低油酸材料。3種子活性的測(cè)定植物體內(nèi)的脫氫酶大多難被提取,難以用傳統(tǒng)的生物化學(xué)方法對(duì)它們進(jìn)行研究。油酸脫氫酶FAD2(EC1.3.1.35,1-?；?2-油?；?sn-甘油-磷酸膽堿脫氫酶)是植物產(chǎn)生多聚不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶,它存于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上,以1-酰基2-油?；?sn-甘油-磷酸膽堿為底物,需氧條件下以NADH為還原劑,生成多聚不飽和脂肪酸、亞油酸(Cis9,12-18:2)和α-亞麻酸(Cis9,12,15-18:3),它們?cè)谥参锏哪は到y(tǒng)中主要以酯化的形式存在,因此,測(cè)定油菜種子微粒體中蛋白濃度是油酸脫氫酶系活性測(cè)定的重要基礎(chǔ)。該試驗(yàn)采用Bradford法測(cè)定油菜種子微粒體蛋白濃度,并進(jìn)行了精密度試驗(yàn),結(jié)果良好。目前其他植物微粒體的制備主要采用差速離心法,其基本原理是建立在不同大小和密度的顆粒在不同速度的離心場(chǎng)中沉降速度存在差別的基礎(chǔ)上。傳統(tǒng)的方法是在低速對(duì)勻漿液進(jìn)行2次離心,第1次去掉葉綠體,第2次去掉線粒體。該試驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行了改進(jìn),采用了1次高速離心的方法去除上述組分,