免疫金標記技術(shù)的研究

免疫金標記技術(shù)的研究

免疫金標記是一種將金溶膠用作標記的新免疫標記技術(shù)。該技術(shù)簡單易用。已經(jīng)成為繼熒光素、酶和陰離子等標記技術(shù)之后的一種新檢測技術(shù)。金標抗體檢測將反應(yīng)載體和信號輸出融為一體，其穩(wěn)定性和柔軟性決定了檢測方法的穩(wěn)定性和檢測限制。我們是基于研究納米顆粒和受體之間的相互作用，確定了闡明這些相互作用的機制，為提高該方法的靈敏度和穩(wěn)定性奠定了基礎(chǔ)。本文以納米金溶膠和AFB1單克隆抗體McAb為材料,研究了標記過程和標記條件,獲得了穩(wěn)定、靈敏的免疫金標AFB抗體探針.并且通過透射電鏡、紫外-可見光譜、紅外光譜、圓二色譜、熒光光譜等手段分析了標記前后金溶膠和抗體蛋白的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象變化,為揭示納米金與抗體蛋白之間的作用機理提供突破點.1實驗部分1.1儀器和檢測方法Spectronic1.70GBC紫外-可見光分光光度計(意大利),HitachiH7000,透射電鏡(日本),RCTIKA磁力攪拌器(德國),Nicolet5DXC紅外光譜儀(美國),島津RF-5301PC熒光光譜儀(日本),J-500C圓二色譜儀(德國),CentrikonT-124高速冷凍離心機(瑞士).1.2實驗過程1.2.1金溶膠抗體蛋白實際用量的測定向5mL金溶膠溶液中加入1mL不同濃度的抗體蛋白溶液,充分混勻.5min后加入質(zhì)量分數(shù)為10%的氯化鈉溶液1mL,然后分別測定520nm和580nm的吸光值A(chǔ),以A520-A580為縱坐標,蛋白質(zhì)用量為橫坐標作一曲線,取曲線拐點處的蛋白質(zhì)用量為最小保護劑量,在此基礎(chǔ)上再加20%為穩(wěn)定金溶膠的抗體蛋白實際用量.1.2.2金溶膠的純化取一定體積的金溶膠溶液,在磁力攪拌的同時,緩慢滴加0.1mg/mLMcAb溶液(將McAb溶于0.01mol/LpH=7.4的PBS緩沖液中).金溶膠的濃度為[Au]=2.4×10-5mol/L.靜置0.5h后通過2次4℃冷凍和超速離心進行純化.首次離心轉(zhuǎn)速10000r/min,時間45min,棄去上清液,沉淀用質(zhì)量分數(shù)為10%的BSA溶液溶解,進行第二次離心;第二次用質(zhì)量分數(shù)為10%～30%的甘油密度梯度離心,轉(zhuǎn)速7000r/min,時間45min,用于除去未標記的蛋白和金顆粒聚集體,收集中間紅褐色部分備用.1.2.3納米金顆粒物理性能對獲得的納米金抗體復(fù)合物進行TEM測試,測定納米金顆粒復(fù)合物的顆粒形態(tài)、直徑和均勻度,用統(tǒng)計學(xué)處理所測的50個金顆粒,計算平均直徑和標準偏差.1.2.4mcab抗體的免疫活性測定采用間接競爭ELISA方法測定McAb抗體標記前后的效價和親和常數(shù).穩(wěn)定性分析根據(jù)不同貯藏時間(常溫,25℃)McAb抗體的免疫活性保存率來評價.以ELISA陰性孔(不含AFB1)和陽性孔(AFB1質(zhì)量濃度為1ng/mL)吸光度差值表示McAb抗體的免疫活性.貯藏過程中,測定值與初始值之比為免疫活性的保存率(%).每10d測定一次,共貯藏60d.1.2.5熒光光譜的測定固定McAb的量,加入不同濃度的納米金溶膠(Au濃度介于3～30μmol/L之間),檢測體系的熒光光譜.所用的激發(fā)和發(fā)射光譜帶寬均為1.5nm,狹縫寬度為1nm,激發(fā)光波長為280nm,測得熒光發(fā)射光譜,再以Δλ=15nm和Δλ=60nm測定樣品的同步熒光光譜.1.2.6色譜分析測試分別對McAb和McAb與納米金溶膠復(fù)合物進行圓二色譜分析,測試范圍190～300nm,測試溫度25℃,掃描速度100nm/min,掃描步長0.1nm,掃描帶寬1.5nm.2結(jié)果與討論2.1最佳ph值及用量的確定金溶膠在500～550nm之間有強的吸收峰,是金納米粒子的表面等離子體共振吸收峰.由圖1可知,隨著McAb加入量的逐漸增加,在520nm附近的等離子體吸收峰的強度逐漸降低,推測McAb與金納米粒子發(fā)生了相互作用.當McAb量逐漸增多時,吸收峰降低并逐漸平緩,這表明抗體上的金顆粒結(jié)合位點達到飽和.圖2顯示,與McAb作用后,前5min內(nèi)的金溶膠等離子共振吸收峰降低最明顯,5min后趨于穩(wěn)定,作用16h時,吸收光譜仍沒有明顯變化.表明McAb與金納米粒子之間的作用在5min內(nèi)基本完成,并且作用后的結(jié)合物相對穩(wěn)定.不同pH(pH=4.5,6.0,7.5,8.0,9.0,10.0)條件下,金納米粒子與McAb蛋白作用后,其共振吸收峰降低的趨勢與280nm的吸收峰升高的趨勢是一致的,除了pH=4.5時的共振吸收峰發(fā)生大幅度的展寬和紅移之外,其它pH下的吸收峰之間不存在明顯差異.推測是因為pH=4.5時對金溶膠的穩(wěn)定性產(chǎn)生了破壞作用.抗體蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì),在不同pH值的溶液中具有不同的電荷狀態(tài),在等電點處容易發(fā)生沉淀(一般等電點pH為5左右).黃曲霉毒素抗原抗體的特異性結(jié)合必須在合適的pH值(6～9)環(huán)境下進行,pH值過高或過低將影響抗原和抗體的理化性質(zhì).不同pH條件下金溶膠標記AFB1單抗McAb在520和580nm的吸光度結(jié)果表明,在pH=7.4時金溶膠標記物吸光值之差最大,標記產(chǎn)物最穩(wěn)定.當金濃度為2.4×10-5mol/L時,隨著金顆粒直徑的增大,McAb蛋白的實際用量降低,結(jié)果見表1.2.3金屬元素和金屬酶標記的免疫特性在金標探針體系中存在各種直徑近似的顆?；旌象w,同時還混有未參與標記的過量抗體成分.為得到更均勻的金溶膠顆粒,采用甘油密度梯度離心,經(jīng)分級后制得探針顆粒直徑的變異系數(shù)(CV)小于25%,離心后所得金復(fù)合物顆粒標準偏差為3.05nm,變異系數(shù)小于25%,但無法通過透射電鏡判斷McAb與金顆粒的作用位置和作用方式.標記前后紅外光譜的特征吸收并未發(fā)生明顯改變,表明標記過程沒有改變抗體蛋白的特征官能團.通過ELISA方法比較標記前后抗體的免疫特性,與未標記抗體相比,金標復(fù)合物的抗體親和力從原來的3.81×107提高到4.14×107,抗體效價也從2.00×105提高到2.20×105(測定次數(shù)為3次).研究結(jié)果還顯示,經(jīng)納米金標記后,抗體穩(wěn)定性增加,于37℃貯藏60d后,抗體的熱穩(wěn)定性從原來的42%提高到53%.2.4熒光能量轉(zhuǎn)移的機制熒光法是研究生物大分子相互作用的重要手段.固定McAb的量,改變金溶膠濃度,McAb的內(nèi)源熒光強度隨著金溶膠濃度的增加而有規(guī)律性地降低,但發(fā)射峰位及峰形不變(圖3),說明納米金溶膠對McAb熒光有猝滅作用.由圖4可見,隨著溫度的升高,McAb猝滅曲線的斜率降低,由此可初步判斷該過程不是動態(tài)猝滅(動態(tài)猝滅依賴于擴散速率,因而增高溫度導(dǎo)致擴散加快,猝滅常數(shù)隨溫度的升高而增大),而是靜態(tài)猝滅.若Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù),由于生物大分子的熒光壽命t0=10-8s,而各類猝滅劑對生物大分子擴散碰撞猝滅常數(shù)Kq的最大值為2×1010L/(mol·s).由圖4曲線的斜率可得15和25℃的猝滅常數(shù)Ksv分別為39.74×103L/mol和22.60×103L/mol,所以Kq分別為39.74×1011和22.60×1011,遠大于Kq的最大值,這進一步證實猝滅過程為靜態(tài)猝滅.在靜態(tài)猝滅作用中,靜態(tài)猝滅熒光強度與猝滅劑的關(guān)系可由熒光體-猝滅劑分子間的結(jié)合常數(shù)表達式推導(dǎo)求出.以lg(F0-F/F)對lgc0作圖;由所得直線斜率可知抗體蛋白McAb上的金顆粒結(jié)合位點數(shù)n與結(jié)合常數(shù)KA.線性回歸方程為y[lg(F0-F)/F]=0.8928x(lgc0)+3.8457,R2=0.999,所以,抗體蛋白上的金顆粒結(jié)合位點數(shù)為0.8928,結(jié)合常數(shù)KA為7.009×103.表明納米金溶膠與McAb有較強的結(jié)合作用.將金溶膠溶液的吸收光譜與McAb的發(fā)射光譜比較,兩者間有重疊部分(見圖5),說明McAb與金溶膠顆粒之間發(fā)生了熒光能量轉(zhuǎn)移.由于金納米顆粒并未使McAb發(fā)射光譜的峰形發(fā)生改變,所以,應(yīng)該不是輻射能量轉(zhuǎn)移.根據(jù)F?rster偶極-偶極無輻射能量轉(zhuǎn)移理論,當兩種化合物分子滿足以下條件時,將發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移:(1)供能體發(fā)射熒光;(2)供能體的熒光發(fā)射與受能體的吸收光譜有足夠的重疊;(3)供能體與受能體足夠接近,最大距離不超過7nm.根據(jù)上述分析,可以認為McAb內(nèi)的色氨酸殘基與納米金溶膠之間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移作用,從而使McAb熒光被猝滅.2.5mcab與金納米粒子作用的構(gòu)象變化蛋白質(zhì)的同步熒光光譜可被用來初步判斷蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化.相同條件下McAb和McAb與金顆粒復(fù)合物的同步熒光光譜見圖6.298nm處的吸收峰歸屬于色氨酸殘基,340nm處的吸收峰歸屬于酪氨酸殘基.與未加入金顆粒的McAb相比,酪氨酸殘基和色氨酸殘基的熒光強度顯著降低,而最大發(fā)射波長沒有發(fā)生明顯的位移,說明二者反應(yīng)后McAb所處環(huán)境的極性未發(fā)生明顯改變.圓二色譜(CD)能定量分析McAb與金粒子作用過程中McAb的構(gòu)象變化.由圖7可見,McAb在195nm處表現(xiàn)為正吸收峰,在208和220nm處表現(xiàn)為負吸收峰,是高α-螺旋結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的CD特征光譜.與金納米粒子作用后,McAb在195nm處的正吸收峰升高,而在208和220nm處的吸收負峰略降低.表明與金溶膠作用后McAb的結(jié)構(gòu)發(fā)生了微弱的變化.通過CD光譜進行定量分析,McAb的構(gòu)象組成為α-螺旋,含量從52.5%升高到54.2%,β-折疊的含量從21.0%降到19.8%,轉(zhuǎn)角含量從4.6%升高到7.3%,無規(guī)則卷曲20.2%略增為20.5%.表明McAb與金納米粒子作用后結(jié)構(gòu)略加緊密.2.6熒光符合表征通過上述光譜分析可以對金溶膠與McAb之間的相互作用作以下描述:納米金對McAb具有熒光猝滅作用,猝滅類型為靜態(tài)猝滅,猝滅的速率常數(shù)隨著溫度升高而降低.金溶膠溶液的吸收光譜與McAb的發(fā)射光譜分析結(jié)果表明,McAb與金溶膠顆粒之間發(fā)生了熒光能量轉(zhuǎn)移.同步熒光光譜顯示,二者反應(yīng)后McAb所處環(huán)