大熊貓精液超低溫冷凍方法的研究

大熊貓精液超低溫冷凍方法的研究

20世紀(jì)70年代以來(lái)，現(xiàn)場(chǎng)飼養(yǎng)的大麥數(shù)量減少到1000個(gè)（胡金耀，1999）。人們?cè)噲D通過繁殖拯救這種瀕危物種。現(xiàn)在，大麥?zhǔn)震B(yǎng)了126個(gè)個(gè)體，分散在32個(gè)單位。最大的單位只有37個(gè)，最小的單位只有一只（謝忠等，1999）。此外，創(chuàng)造一個(gè)人工動(dòng)物模型的比例只有21.1%左右。他們可以自然雜交，或通過人工培養(yǎng)（林伯格等，1998）。在許多動(dòng)物的飼養(yǎng)部門，沒有可以自然雜交的動(dòng)物。不能自然雜交的雌性只能用新鮮的東西和冷凍的東西來(lái)教學(xué)和指導(dǎo)人類。在之前的研究中，由于35%40%的冷杉溶液的脫絲率（張安等，1991，葉志勇等，1991），只評(píng)估冷杉溶液本身的活力，而對(duì)溶液前后的精氣形態(tài)、頂體正常率和運(yùn)動(dòng)條件的研究沒有進(jìn)行比較。為建立標(biāo)準(zhǔn)的鉆石冷精法，進(jìn)一步提高山羊人工繁殖的成功率，避免近親繁殖，本文對(duì)四川盆地的9個(gè)體有足夠的經(jīng)驗(yàn)和勇氣進(jìn)行了人工采集，并比較了三種冷冷凍方法的冷卻效果。不同的稀釋液和離心液對(duì)大鼠精質(zhì)素質(zhì)的影響。1材料和方法1.1模式1:自然交配,自然交配林楠:14.5歲,1984年生于白水江,體重74kg,健康,因?yàn)楣舸偏F而沒有放對(duì),是人工授精的主要供精者.希夢(mèng):5.5歲,1993年9月19日生于臥龍繁殖場(chǎng),是冬冬(358)和盼盼的后代,體重117kg,健康,睪丸發(fā)育好,質(zhì)地正常.健健:5.5歲,1993年9月19日生于成都動(dòng)物園,體重84kg,體質(zhì)較差,睪丸發(fā)育較差,質(zhì)地較軟.大地:7.5歲,1992年9月22日生于臥龍繁殖場(chǎng),是冬冬和盼盼的后代,體重116.6kg,健康,1998年發(fā)情,是圈養(yǎng)種群中能自然交配的子代中的3只種公獸之一.樂樂:16.5歲,1983年生于寶興,體重105kg,患皮膚癌已3a,睪丸發(fā)育好,質(zhì)地正常.在患病之前,曾多次采集.盼盼:14.5歲,1985年生于寶興,體重130.5kg,健康,是圈養(yǎng)種群中能自然交配的少數(shù)種公獸之一.壯壯:10.5歲,1989年生于南坪,體重94.1kg,健康,沒有繁殖過.迪迪:5.5歲,1994年10月5日生于臥龍繁殖場(chǎng),是盼盼和佳佳(230)的后代,體重110.5kg,健康,1994年4月有發(fā)情表現(xiàn),但不是很典型.新興:12.5歲,1987年生于寶興,體重121kg,健康,是圈養(yǎng)種群中進(jìn)行自然交配的少數(shù)種公獸之一.1.2精子質(zhì)量的測(cè)定大熊貓用氯胺酮4～6mg/kg,鋪以龍朋0.3～0.5mg/kg進(jìn)行麻醉保定.電極棒直徑2.6cm,長(zhǎng)20cm,3個(gè)長(zhǎng)條電極長(zhǎng)6.5cm,高0.3cm,呈45°,90°和135°排列.刺激電壓從2～3V開始,根據(jù)大熊貓的反應(yīng)即后肢收縮的程度,緩慢增加,每次刺激時(shí)間2s,兩次刺激的間隔時(shí)間為3s,持續(xù)刺激直至采出精液,連續(xù)刺激不能超過30次,如果第1次沒有采到精液或采的量太少,隔5min后再連續(xù)刺激1次.把采集的精液放入37℃的水浴箱中,測(cè)量精液的體積,用顯微鏡對(duì)精液的質(zhì)量和形態(tài)學(xué)進(jìn)行分析、評(píng)估.精子質(zhì)量用精子的活力(motility)、活率(percentlive)、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)(status)、pH值、頂體的正常率(Normalapicalridge)和精子形態(tài)學(xué)(Morphology)來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià).活力(motility)百分?jǐn)?shù):取少量精液于保溫37℃的載玻片上,計(jì)數(shù)100個(gè),凡是活動(dòng)的精子記為有活力的精子,以百分?jǐn)?shù)計(jì)算;活率(percentlive):滴1滴精液于保溫37℃的載玻片上,在旁邊滴上同樣體積的Pap染液,用一載玻片將其混合后涂片(不能來(lái)回涂),待片干后在顯微鏡下計(jì)數(shù),白色精子為活精子,粉紅色是死精子;運(yùn)動(dòng)狀態(tài):評(píng)價(jià)精子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài),用1～5表示:1是轉(zhuǎn)圈;2是曲線運(yùn)動(dòng);3是直線運(yùn)動(dòng),但運(yùn)動(dòng)狀態(tài)慢;4是較快的直線運(yùn)動(dòng);5為很快的直線運(yùn)動(dòng);pH值:取少量精液滴在pH試紙上;頂體正常率(Normalacrosome):用POPE染液染色,吸取1μL精液+9μLPOPE染液,染色90s,涂片.片干后用100倍油鏡觀測(cè).A.正常頂體(Normalapicalridge)是深紫色;B.受損的頂體(Damagedapicalridge)也是深紫色,但頂部表面凹凸不平,成鋸齒狀;C.頂體丟失(Missingapicalridge)時(shí),頂部是白色;D.頂體蓬松(Looseacrosomecap):頂部是白色,頂部表面凹凸不平,頂體損傷最嚴(yán)重.精子形態(tài)學(xué):把2μL精液加入200μL0.3%甘油醛中固體,取少量于載玻片上用油鏡觀察.1.3冷凍液(1)液氮罐的制備將精液用冷凍稀釋液作1∶3稀釋,在4℃冰箱中平衡4h,先把凍精板放入裝有液氮的金屬槽中侵3次,然后把凍精板提升到距液氮面5cm處,用溫度計(jì)測(cè)量平板的溫度,當(dāng)溫度下降到-80℃時(shí),用微量吸管快速地把平衡好的精液以40和80μL/粒滴在凍精板上,2min之后把凍精板快速侵入液氮(-196℃)中,用平衡好的鑷子把精粒裝入玻璃小瓶中,放進(jìn)液氮罐長(zhǎng)期保存.(2)管.液氮罐的制備將精液用TEST和SFS作1∶3稀釋,在4℃冰箱中平衡4h,冷凍前,把精液吸入細(xì)塑料管中,每管0.25mL,一端事先塞有棉花,另一端在吸入精液后(留5mm以便密封)用在酒精燈上燒熱的鉗子封閉.然后把細(xì)管放在平衡好的試管架上層(離液氮7.5cm,～-20℃)1min,再放在試管架下層(離液氮2.5cm,～-80℃)1min,最后放入液氮中,2min后裝入紙筒中,放進(jìn)液氮罐長(zhǎng)期保存.(3)冷凍液氮成分配把200μL精液加入400μL稀釋液中,裝入1.5mL的塑料試管中,在4℃的冰箱中平衡4h后,放在離液氮7.5cm高的平板上冷凍10min,然后放入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存.2研究結(jié)果2.1精子活力、活力、畸形率分布9只雄性大熊貓的年齡范圍是5.5歲～16.5歲,體重是84～130.5kg,共進(jìn)行了17次電刺激采精,最多的采精4次,最少采精1次.因?yàn)槟挲g和身體狀況的差異,其精液的質(zhì)量也有差異(見表1).9只雄性熊貓的平均體重為108.1±15.0kg,睪丸體積為289.4±108.6cm3,刺激電壓2～8V,射精電壓4～8V,平均每次采精體積為3.5±1.9mL,精子密度為(995.2±782.6)×106/mL,每次采精總量為(3907.0±2981.7)×106個(gè),精液平均活力為(69.1±28.9)%,活率為(79.6±23.1)%,運(yùn)動(dòng)速度為2.7±1.1,畸形率為(39.4±32.2)%,平均頂體正常率為(85.8±31.2)%,pH值為7.9±0.4.3只5.5歲的雄性大熊貓都已能產(chǎn)精,但希夢(mèng)和健健的精子的畸形率都很高,分別為96%和92%,活力也較差,只有迪迪的精液比較好,活力、活率和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)都較高,精子的畸形率為32%,異常的精子主要是中段折斷.盼盼、大地和新興是能進(jìn)行自然交配交繁殖了后代的種公獸,其體重為122.7±7.1kg,精液活力為(77.3±5.8)%,運(yùn)動(dòng)狀態(tài)為3.0±0.5,精子畸形率為(18±9.6)%,頂體正常率為(92.7±1.5)%,pH值為8.0±0.1.2.2超低溫冷凍后營(yíng)造冷凍大蒜/干酵母粉液冷凍對(duì)制備的影響見表1分別取新鮮精液100μL于300μLTEST和SFS稀釋液中,用顆粒法進(jìn)行超低溫冷凍,冷凍后馬上解凍進(jìn)行對(duì)比分析(見表2).TEST和SFS兩種稀釋液來(lái)冷凍大熊貓的精液的效果比較接近,經(jīng)t檢驗(yàn),活力(TEST與SFS)的t值=1,P>0.1,頂體正常率的t值=0.44,P>0.1,解凍后的都沒有明顯的差異.2.3顆粒冷凍和顆粒凍精的比較取鮮精0.25mL加入0.75mL稀釋液中,分別用顆粒、細(xì)管和小試管3種冷凍方法進(jìn)行冷凍,顆粒冷凍的體積是40μL和80μL,細(xì)管是250μL,小試管是500μL,冷凍后在TCM199中解凍,比較解凍后精液的活力、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和頂體的正常率(見表3).用顆粒和細(xì)管兩種方法冷凍的精液的活力、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和正常頂體率都很接近,顆粒和細(xì)管的活力和頂體正常率比小試管的要高得多,經(jīng)t檢驗(yàn),顆粒冷凍的活力與小試管的t值=3.36,P<0.05,有顯著的差異,細(xì)管冷凍的活力與小試管的t值=0.89,P<0.05,有顯著的差異,顆粒冷凍的頂體正常率與小試管的t值=7.85,P<0.01,有非常顯著的差異,細(xì)管冷凍的頂體正常率與小試管的t值=8.9,P<0.001,有非常顯著的差異.在進(jìn)行顆粒冷凍時(shí),對(duì)比研究了40μL和80μL兩種體積的顆粒解凍后的活力、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和頂體的正常率(見表4).40μL和80μL體積的顆粒凍精的質(zhì)量相同,它們解凍后的活力、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和頂體的正常率沒有差異.2.4最終的甘油含量把200μL鮮精加入600μL稀釋液中,離心8min(300g),離心后去除上清液,加入1.2mL稀釋液,使最終的甘油含量為5%;把200μL鮮精加入400μL稀釋液中,不離心,用同樣方法進(jìn)行超低溫冷凍保存.解凍后用精子的活力、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和頂體的正常率3項(xiàng)指標(biāo)來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)(見表5).離心后的精液經(jīng)超低溫冷凍后,活力、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和頂體正常率與未離心的精液都較接近,說明離心除去精漿后對(duì)大熊貓精子的活力、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和頂體正常率沒有明顯的影響.2.5單次采精試驗(yàn)取大熊貓新鮮精液0.25加入0.75的稀釋液中,保存于4℃冰箱中,在冷藏4,8,24,48h后每次取少量精液檢測(cè)活力、活率和頂體的正常率,評(píng)價(jià)精液質(zhì)量,以研究短期保存精液的方法.在對(duì)大熊貓精液進(jìn)行4℃低溫保存時(shí),在稀釋液(Test和SFS)中不同加甘油,其效果與含有5%甘油的稀釋液的效果是相同的.大熊貓的精液在4℃低溫保存48h后,其活力平均為46.5%、活率為75%,頂體正常率為69%,可以用來(lái)進(jìn)行人工授精,以減少麻醉采精的次數(shù).3不同冷凍方法對(duì)精子畸形率的影響在研究的9只雄性大熊貓中,希夢(mèng)和健健(5.5歲)的精子的畸形率很高,分別為96%和92%,其它7只大熊貓精子畸形率在11%～42%之間,平均值是27%.這一結(jié)果與Platz等(精子畸形率為15%～30%,1983)和馮文和(精子畸形率為29.73%,1991)的研究結(jié)果基本一致,但與馮文和等1998年的研究結(jié)果,5只熊貓的精子畸形率為55.44%(41.13%～71.46%)有些差異.顆粒、細(xì)管和小試管3種冷凍方法相比較,顆粒和細(xì)管比小試管要好,其原因主要是前二者的表面積較大,從4℃至-192℃的時(shí)間短,每分鐘降溫-80℃,而小試管的精液體積大,表面積較小,降溫的速度慢,每分鐘降溫-20℃,因而造成精子死亡或頂體損傷,降低了精液的活力,減少了頂體正常率.細(xì)管和顆粒兩種不同的冷凍方法效果差不多.細(xì)管的冷凍過程較顆粒方便,時(shí)間容易控制,因?yàn)榫罕幻芊獗４?不易丟失和受到污染,是一