藥用植物甘草栽培存在的問題及對策

藥用植物甘草栽培存在的問題及對策

甘草是甘草科的一種植物。分布于中國甘肅、河北、遼寧、內(nèi)蒙古、寧夏、青海、陜西、山東和新疆其他地區(qū)。此外，它還分布在阿富汗、哈薩克斯坦、定金斯坦、俄羅斯和塔吉克斯坦的國家?！吨袊幍洹?010年版規(guī)定甘草有3個來源,即烏拉爾甘草G.uralensisFisch.、光果甘草G.glabraLinn.及脹果甘草G.inflataBatalin.。甘草是最常用的大宗藥材之一,以根及根莖入藥,具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛和調(diào)和諸藥等作用,素有“國老”、“十方九草”之譽。除藥用價值外,甘草還可以作為食品矯味劑及煙草添加劑等原料。商品甘草過去主要來源于野生資源,由于過度采挖,甘草野生資源遭到了嚴重破壞,國務院已明令禁止采挖野生甘草(國發(fā)13號),目前栽培甘草已經(jīng)是主流商品。但是,栽培甘草質(zhì)量差異較大,大部分栽培甘草存在品質(zhì)退化和甘草酸量低等問題,達不到《中國藥典》和《日本藥典》規(guī)定的甘草酸量不低于2.0%和2.5%的合格標準,既影響甘草臨床療效,也制約栽培甘草的出口。人們試圖通過多種手段來解決上述甘草資源可持續(xù)發(fā)展這一“瓶頸”問題。由于甘草在栽培條件下4~5年才能收獲種子,而利用地下根莖進行營養(yǎng)繁殖的繁殖系數(shù)較低,這些都限制了甘草系統(tǒng)育種工作的開展。而藥用植物組織培養(yǎng)技術作為中藥生物工程的核心內(nèi)容之一,在藥用植物的資源保護和可持續(xù)發(fā)展方面具有重要的作用。早在20世紀八九十年代,芮和愷等和于林清等就開始了對甘草組織培養(yǎng)的大量研究,試圖誘導再生植株。經(jīng)過多年的發(fā)展,甘草的組織培養(yǎng)在離體再生、快速繁殖、次生代謝產(chǎn)物積累、毛狀根誘導等多方面取得了一定的成果。本文對甘草的組織培養(yǎng)進行綜述,以期為部分解決甘草資源的替代問題以及以組織培養(yǎng)為基礎的基因與代謝工程提供有效的途徑和理論指導。1水浸處理對甘草種子發(fā)芽率的影響目前大量文獻報道顯示在對甘草進行離體培養(yǎng)時,最常用的外植體材料為甘草種子無菌培養(yǎng)后所獲得的無菌苗。甘草的種子由于種皮較厚,不易自然萌發(fā),所以培養(yǎng)前通常需進行預處理,以提高其發(fā)芽率。種子的預處理方式一般有2種:一種是濃硫酸浸種,一種是溫湯浸種。濃硫酸浸種時,多采用98%硫酸浸泡處理60~70min,自來水充分洗凈。溫湯浸種時通常采用40℃溫水浸泡處理30min以上。王彥芹等采用濃硫酸浸種和溫湯浸種時差異顯著,前者的甘草發(fā)芽率可達到85.77%,而后者種子不吸脹,發(fā)芽率為零。這一實驗結果與本課題組的實驗結果有較大的差異。本課題組在對甘草種子進行浸泡處理時,發(fā)現(xiàn)濃硫酸浸種與溫水浸種的發(fā)芽率都較高,沒有顯著性差異。但濃硫酸浸種時種皮易破損,從而導致種胚的破壞,會造成一定比例的種子損失;而溫水浸種時不會造成種皮的破壞,效果反而略好于濃硫酸。同時本課題組對濃硫酸及溫水的浸泡時間進行了梯度考察,發(fā)現(xiàn)濃硫酸浸泡時間不宜過長,以30~40min效果最好,這也與前述報道中1h以上的浸泡時間有明顯的差別,而與劉曉丹等的實驗結果較為接近。溫水的浸泡時間也以30min為宜。在對甘草種子進行表面滅菌時,多采用75%乙醇結合0.1%~1.0%升汞共同滅菌的方法,首先用75%乙醇浸泡處理30~60s,無菌水沖洗3次,然后用0.1%~1.0%升汞浸泡處理8min左右,無菌水沖洗5次,基本上可達到無菌的要求。將種子接種到MS基本培養(yǎng)基上,在25℃,黑暗條件下培養(yǎng)1周左右,即可得到甘草無菌苗。2外植體材料的誘導大量文獻報道顯示,在誘導甘草愈傷組織時,多以無菌苗的子葉、下胚軸或胚根作為外植體材料,以MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基,添加NAA、2,4-D、6-BA等植物生長調(diào)節(jié)劑,在25℃、黑暗條件下誘導愈傷組織的發(fā)生。但不同的研究者對以上具體條件的報道又有所差異。范小峰等認為不同的外植體中,以甘草下胚軸愈傷組織誘導率最高,可達到94%;不同的植物激素中2,4-D有助于誘導產(chǎn)生非胚性愈傷組織,而一定濃度的6-BA與NAA配合,可誘導產(chǎn)生胚性愈傷組織。王彥芹等在其研究中發(fā)現(xiàn),以甘草無菌苗的下胚軸為外植體,在MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L以及MS+2,4-D2.0mg/L+6-BA2.0mg/L培養(yǎng)基上,3~4周之后就可以產(chǎn)生瘋長型愈傷組織,且不易褐變,在培養(yǎng)一段時間之后也不會出現(xiàn)生長停滯現(xiàn)象。雷呈等在對脹果甘草進行愈傷組織誘導時發(fā)現(xiàn),適宜的外植體材料為下胚軸,非胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0mg/L+2,4-D0.5mg/L,而胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+KT0.5mg/L+IBA0.1mg/L。劉穎等以甘草無菌苗的胚根為外植體,考察不同濃度激素組合對愈傷組織誘導和繼代培養(yǎng)的影響時發(fā)現(xiàn):以誘導率為指標,NAA對甘草細胞脫分化的影響最為顯著;以相對生長速率為指標,6-BA、2,4-D、NAA對甘草細胞生長分裂的影響均較為顯著。誘導甘草愈傷組織的最佳激素組合為2,4-D1.0mg/L+NAA1.0mg/L+6-BA1.0mg/L+KT0.3mg/L。此外,柳福智等對甘草愈傷組織誘導中氮源的影響進行了考察,結果發(fā)現(xiàn)以下胚軸作為外植體材料,在MS+6-BA0.6mg/L+2,4-D0.5mg/L+KT0.4mg/L+NAA0.6mg/L誘導培養(yǎng)基上,不同濃度的氮源對下胚軸愈傷組織的誘導和生長有顯著的影響,較低和較高濃度的氮源均不利于愈傷組織的生長,較為適宜的最佳氮源濃度為60mmol/L。計巧靈針對耐鹽性甘草愈傷組織的誘導進行了研究,以促進在鹽堿灘人工栽培甘草技術的發(fā)展。結果發(fā)現(xiàn)子葉塊和胚軸段在MS+6-BA1.5mg/L+2,4-D1.2mg/L+NaCl100mg/L培養(yǎng)基上脫分化效果良好,可獲得大量淡黃色、稍透明的愈傷組織。在甘草愈傷組織誘導方面,多數(shù)研究[11,12,13,14,15,16,17,18,19,20]表明以下胚軸作為外植體材料誘導愈傷率最高,其次為子葉。通常以MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基,在所有植物激素中6-BA是必不可少的,而2,4-D則有利于非胚性愈傷組織的誘導及繼代培養(yǎng)。通常NAA、6-BA和2,4-D3種激素配合使用,但也有其他的激素使用類型。本課題組在實驗過程中得出的結論與上述內(nèi)容略有不同,而與尚福強等的報道在誘導培養(yǎng)基配方與外植體來源方面較為接近。就3種外植體材料而言,最易愈傷的是胚根,其次為下胚軸,而子葉則不易于愈傷;另外,本課題組發(fā)現(xiàn)最佳誘導培養(yǎng)基配方為MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D0.5mg/L+NAA0.2mg/L,利用此培養(yǎng)基可在較短時間內(nèi)獲得大量白黃色疏松的愈傷組織。根據(jù)這一實驗結果,推測甘草最重要的次生代謝產(chǎn)物甘草酸主要集中于甘草的根部,因此如果組織培養(yǎng)的目的是誘導愈傷組織、建立懸浮細胞培養(yǎng)體系,進而收獲其中的次生代謝產(chǎn)物,那么起始外植體材料應該以胚根為宜;相反,考慮到各來源外植體材料在誘導分化培養(yǎng)時的難易程度,如果組織培養(yǎng)的目的是誘導甘草離體培養(yǎng)再生植株的獲得,那么起始的外植體材料應該以下胚軸為宜。3牧草分離植株的獲得從前人研究結果可知,甘草愈傷組織誘導較為容易,但其分化成芽則比較困難,分化率僅在2.5%~6.0%。而且就外植體來源而言,通常來源于下胚軸的愈傷組織分化成芽的幾率要高于來源于子葉及胚根的愈傷組織。對于誘導分化方面的報道近些年來并不多見。在對甘草組織培養(yǎng)早期的研究中,芮和愷等報道了分化培養(yǎng)基為ZT2mg/L、6-BA2mg/L、KT2mg/L+ZT2mg/L+NAA0.2mg/L,生根培養(yǎng)基則為1/2MS+NAA0.05mg/L,當芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上,約2周可以從切口處長出短而粗的白色根系,從而形成完整植株。但僅限于下胚軸來源的愈傷組織,其他來源的愈傷組織均不能獲得再生植株。雷呈等在甘草離體培養(yǎng)的過程中,利用培養(yǎng)基MS+6-BA0.5mg/L+KT0.5mg/L+IBA0.1mg/L,成功誘導獲得由大量淺綠色胚性細胞組成的胚性愈傷組織。但將胚狀體放入再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)后,胚狀體再生能力喪失,褐化死亡,因而未能分化得到再生植株。計巧靈將甘草愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS+6-BA0.5mg/L+KT0.5mg/L+NAA1.0mg/L+NaCl200mg/L培養(yǎng)基上,成功分化出大量的不定芽。適當降低培養(yǎng)溫度至18~22℃,提供自然光照,并適量添加GA3的情況下有利于壯芽的形成;最適合生根的培養(yǎng)基是1/2MS+IAA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+NaCl200mg/L,生根率可達66.26%。該實驗最終成功獲得了具有耐鹽性的甘草再生植株。于林清等和安利佳等也分別獲得了甘草離體再生植株,其過程大致相同,均為愈傷組織致密化、出現(xiàn)顆粒狀,隨后出現(xiàn)綠色芽點,進而分化成無根苗,誘導生根后獲得再生植株;但其使用的分化培養(yǎng)基配方差異較大,前者分化培養(yǎng)基為MS+6-BA0.8mg/L+KT0.1mg/L+NAA1.5mg/L,而后者則采用1/2B(MS+B5的最佳組合)+6-BA0.7mg/L+NAA0.2mg/L。二者在基本培養(yǎng)基類型、激素類型及配比方面均存在差異,但所使用的生根培養(yǎng)基則大致相同,均為1/2MS培養(yǎng)基中添加一定量的NAA。鄒翠霞等對刺果甘草進行組織培養(yǎng)誘導再生較為成功,其實驗結果顯示以MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D1.0mg/L作為誘導培養(yǎng)基、以MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L作為分化培養(yǎng)基、以1/2MS+IAA1.0mg/L作為生根培養(yǎng)基,可以獲得較為健壯的再生植株。對該再生植株煉苗后,移栽至以爐灰渣為基質(zhì)的花盆中,以室溫、濕度95%遮陰條件下培養(yǎng)10d后即可轉(zhuǎn)入正常的日光溫室培養(yǎng),成活率可達到69%。雖然刺果甘草不屬于《中國藥典》2010年版甘草的基源,但其誘導再生植株的成功經(jīng)驗也可以為甘草組織培養(yǎng)提供一定的理論依據(jù)及技術指導。本課題組在實驗過程中采用MS+6-BA0.5mg/L+KT1.0mg/L+NAA1.0mg/L作為分化培養(yǎng)基,也成功獲得了甘草無根苗,將無根苗轉(zhuǎn)入1/2MS+IAA0.6mg/L生根培養(yǎng)基中,20~30d可長出多條白黃色、較為粗壯的根,待到根系進一步強健以后,即可進行移栽,但也出現(xiàn)了甘草誘導分化困難、分化率低以及試管苗移栽不易成活等問題。這些問題都在一定程度上增加了甘草組織培養(yǎng)的難度?？傮w而言,甘草愈傷組織誘導分化較為困難,分化培養(yǎng)基以MS或B5作為基本培養(yǎng)基,添加6-BA、ZT、KT等細胞分裂素,三者單獨使用或配合NAA使用。生根培養(yǎng)基則多為1/2MS培養(yǎng)基添加一定量的NAA或IAA。4種植物種的選擇對甘草生長的影響目前報道的甘草快速繁殖的方法多采用以莖尖、腋芽作為外植體誘導叢生芽,以帶葉莖段誘導生根,從而實現(xiàn)快速繁殖的目的,具有較高的繁殖系數(shù),相對簡便易行。葛淑俊等對烏拉爾甘草進行了叢生芽誘導研究,并建立了相應的微繁體系。其研究結果表明適合甘草叢生芽誘導的外植體為生長4~7d的甘草無菌苗子葉節(jié)部位,適合誘導叢生芽誘導的培養(yǎng)基為MS+TDZ0.1mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖20~30g/L。將帶1葉的莖段轉(zhuǎn)接在改良MS+NAA0.1mg/L+6-BA1.0~2.0mg/L培養(yǎng)基上,其增殖倍數(shù)可達到25倍,在1/2MS+核黃素2.0mg/L培養(yǎng)基中生根,煉苗3d后轉(zhuǎn)移到蛭石中,成活率可達96%以上?？傮w來說,1個帶腋芽莖段培養(yǎng)3個月可獲得13906棵生根試管苗,成活13350株。黃玉杰等分別利用甘草莖尖、腋芽作為外植體進行叢生芽的誘導,結果發(fā)現(xiàn)較為適宜的誘導培養(yǎng)基為MS+NAA1.5mg/L+6-BA1.0mg/L,較為適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.05mg/L,生根率可達到80%。梁玉勇等研究結果表明適宜甘草分蘗培養(yǎng)的外植體材料是生長4~7d的無菌苗子葉段,適宜的培養(yǎng)基為MS+NAA0.2mg/L+6-BA1.0mg/L;在生根培養(yǎng)時,真葉段特別是莖尖的效果最好,適宜的培養(yǎng)基為MS+IBA3.0mg/L+KT0.1mg/L;移栽時以培養(yǎng)30d以上,蛭石和河沙為基質(zhì)的效果較好,成活率可達88%以上。本課題組對甘草快速繁殖的研究,實驗結果與葛淑俊等的研究較為類似。綜上所述,甘草的快速繁殖多采用MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基,通常添加NAA和6-BA2種植物生長調(diào)節(jié)劑,但不同研究者在具體的實驗中采用的激素配比略有不同。以此方法可獲得大量的甘草叢生芽,對其進行生根誘導,特別是在添加IBA和KH2PO4的培養(yǎng)基中進行生根誘導,可獲得大量的再生植株,具有較高的繁殖系數(shù)。5誘導、培養(yǎng)抗病劑自Kamada等在1986年建立了顛茄的毛狀根培養(yǎng)體系以來,培養(yǎng)珍貴藥用植物的毛狀根以收獲其次生代謝產(chǎn)物的研究就成為了國內(nèi)外研究的新熱點。毛狀根具有生長快、遺傳穩(wěn)定、有效成分量高等優(yōu)點,近些年來取得了較大的成功。目前已在人參、西洋參、丹參、青蒿等100多種藥用植物中成功建立了毛狀根培養(yǎng)體系,用以收獲其次生代謝產(chǎn)物。我國的張蔭麟等、高京秀、陳士云等、黃煉棟等早在20世紀90年代初就開始對甘草進行毛狀根的誘導和培養(yǎng)。采用的菌株多為發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834,對甘草無菌苗的下胚軸、子葉以及莖段進行誘導,均能成功獲得生長良好的甘草毛狀根。近些年來,國內(nèi)外科研工作者也進行了一些甘草毛狀根的相關研究,但鮮見報道。Wongwicha等等用甘草的幼葉和嫩莖誘導了甘草的毛狀根,并發(fā)現(xiàn)它們可以在1/2MS培養(yǎng)基中迅速生長。盧虹玉等在成功誘導甘草毛狀根的基礎上,又繼續(xù)在毛狀根中對甘草酸代謝途徑上的鯊烯合酶基因進行了過表達研究,結果顯示過表達鯊烯合酶基因的甘草毛狀根中甘草酸的量為空白對照的2.6倍。Zhang等在甘草毛狀根中對甘草黃酮代謝途徑上的查耳酮合酶基因進行了過表達研究,結果顯示培養(yǎng)3周后,空白對照、轉(zhuǎn)基因毛狀根以及用PEG8000(2%)處理過的轉(zhuǎn)基因毛狀根中總黃酮的量分別為0.842%、1.394%、2.838%,從而說明過表達查耳酮合酶基因以及采用PEG8000同時進行處理可大大提高甘草毛狀根中總黃酮的量。Mehrotra等則研究了光果甘草外植體年齡、類型和生理狀態(tài)對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化能力及生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)毛狀根的影響。利用發(fā)根農(nóng)桿菌對甘草的子葉、子葉節(jié)、葉片、莖段、下胚軸、愈傷組織進行毛狀根的誘導,除愈傷組織外,均能獲得毛狀根,其中以下胚軸和子葉節(jié)誘導率高。甘草的毛狀根培養(yǎng)大多采用MS基本培養(yǎng)基,其主要的次生代謝產(chǎn)物為黃酮類化合物。6組織培養(yǎng)中功能基因的添加量甘草組織培養(yǎng)的另一個重要應用就是利用懸浮細胞、愈傷組織或者毛狀根等組織培養(yǎng)物來累積甘草中的重要次生代謝產(chǎn)物,如甘草酸以及甘草總黃酮。為了能夠收獲到更多的次生代謝產(chǎn)物,國內(nèi)外研究者開展了諸如高產(chǎn)細胞株的篩選、有效成分的影響因素分析、活性成分的分離純化及生物反應器的影響[37,38,39,40,41,42]等研究。甘草愈傷組織及毛狀根中所含的次生代謝產(chǎn)物主要為黃酮類化合物。王彥芹等在其研究中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)3~4周的脹果甘草愈傷組織中總黃酮的量可以達到1.1%。余茜等對不同來源的光果甘草愈傷組織中的總黃酮量進行了測定,結果發(fā)現(xiàn)來源于節(jié)間的愈傷組織中總黃酮的量最高;同時如果在培養(yǎng)基中添加水解乳蛋白500mg/L,則可極顯著地增加來源于各外植體的愈傷組織中總黃酮的量。楊世海等研究結果發(fā)現(xiàn)在愈傷組織的培養(yǎng)過程中添加酵母提取物、水解酪蛋白、真菌誘導子、茉莉酸以及稀土元素等均能顯著提高甘草愈傷組織中黃酮類化合物的量。Zhang等在甘草毛狀根中過表達查耳酮合酶基因的實驗結果也提示代謝途徑中功能基因過表達會對最終的次生代謝產(chǎn)物的量產(chǎn)生重要影響。這些都為組織培養(yǎng)生產(chǎn)甘草黃酮提供了一條可借鑒的途徑。楊會琴等在對不同來源的甘草外植體進行組織培養(yǎng)時,發(fā)現(xiàn)其愈傷組織中含有一定量的甘草酸。其中來源于根部的愈傷組織中甘草酸量最高,為70.2mg/g,且黑暗條件更有利于甘草酸的合成,以添加激素組合2,4-D4.0mg/L+KT0.5mg/L對來源于根部的愈傷組織進行懸浮培養(yǎng),甘草酸的質(zhì)量分數(shù)可達到81.6mg/g,比生藥中還要高出51.08%。梁玉玲等對脹果甘草愈傷組織中的甘草酸的量進行測定,發(fā)現(xiàn)甘草酸的質(zhì)量分數(shù)隨著2,4-D質(zhì)量濃度的上升而升高,且在懸浮培養(yǎng)條件下,離體根培養(yǎng)物中甘草酸的質(zhì)量分數(shù)明顯高于其他培養(yǎng)物,比生藥中增加43.3%。而Lu等的研究結果顯示在甘草毛狀根中過表達鯊烯合酶基因會提高毛狀根中甘草酸的量。這也為組織培養(yǎng)生產(chǎn)甘草酸提供了一條途徑。綜上所述,甘草組織培養(yǎng)物中的主要次生代謝產(chǎn)物為甘草黃酮和甘草酸。在組織培養(yǎng)物如愈傷組織、毛狀根中過表達黃酮代謝途徑或三萜代謝途徑上的關鍵功能基因則有利于相應的次生代謝產(chǎn)物的積累。本課題組在對甘草酸代謝途徑上的功能基因進行相關研究時也發(fā)現(xiàn),過表達3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因(3-hydroxy-3methylglutaryCoAreductase,HMGR)以及鯊烯合酶基因(squalenesynthase,SQS)均會對甘草酸代謝途徑下