鐵皮石斛的市場前景

鐵皮石斛的市場前景

喂食側(cè)柏屬植物和多年生附生草本植物，莖的莖為黑色，也被稱為黑節(jié)草，主要分布在浙江、云南、廣西、湖南、貴州等地。鐵皮石斛是我國傳統(tǒng)名貴中藥材,具有滋陰清熱、益胃生津、潤肺明目、清咽利嗓、抗癌防老等功效,是2010版《中華人民共和國藥典》唯一單列收載的石斛屬植物。鐵皮石斛的種子極小、無胚乳,自然條件下需與某些真菌共生才能萌發(fā),很難用實(shí)生苗栽培,而傳統(tǒng)的分株、扦插等方式的繁殖率極低,加上人為的過度采挖和破壞生態(tài)環(huán)境,其資源已瀕臨滅絕,因而被國家列為重點(diǎn)保護(hù)的藥用植物之一。為滿足國內(nèi)外市場經(jīng)濟(jì)發(fā)展和臨床醫(yī)學(xué)的需要,從20世紀(jì)70年代開始,國內(nèi)科研工作者開始對鐵皮石斛組織培養(yǎng)和人工栽培進(jìn)行研究,20世紀(jì)80年代,浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院率先對鐵皮石斛組織培養(yǎng)技術(shù)取得突破并用于生產(chǎn),國內(nèi)掀起了鐵皮石斛的組織培養(yǎng)熱。筆者就近年來鐵皮石斛無菌播種,原球莖誘導(dǎo)、增殖及分化、壯苗生根,叢生芽的誘導(dǎo),離體開花,人工種子與種質(zhì)資源保存,四倍體誘導(dǎo)等組培技術(shù)的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述,以便為今后的研究提供參考。1無菌播種熱帶附生蘭的種子,可以通過處理,以無菌萌發(fā)的方式進(jìn)行萌發(fā)建立無性繁殖系。1.1種子萌發(fā)期不同不同胚齡的鐵皮石斛種子,萌發(fā)率和萌發(fā)期明顯不同。葉秀粦等、曾宋君等對不同胚齡鐵皮石斛種子誘導(dǎo)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn):幼胚胚齡在2月以下時(shí),種子萌發(fā)率很低,隨著胚齡的增長,其萌發(fā)率逐漸升高,萌發(fā)期逐漸縮短,達(dá)一定的胚齡后,萌發(fā)期差異并不顯著。2月以下的種胚播種時(shí)發(fā)育不良,萌發(fā)率低;過晚播種則果皮開裂,果實(shí)內(nèi)的種子易受污染,難以消毒。因此采用4月胚齡的鐵皮石斛種子無菌播種最佳,這時(shí)種子成熟度高、果實(shí)尚未破裂,易進(jìn)行無菌播種,種子萌發(fā)率高且萌發(fā)后的生長狀況好。1.2不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛種子萌發(fā)的影響采用合適的培養(yǎng)基是鐵皮石斛種子萌發(fā)的關(guān)鍵,B5、1/2B5、N6、1/2N6、MS、1/2MS、SH、1/2SH、WPM、VW、KundsonC、White和HyponexNO.1等多種基本培養(yǎng)基都可使鐵皮石斛種子萌發(fā),但萌發(fā)所需的時(shí)間、萌發(fā)率及小苗長勢不同。曾宋君等在研究鐵皮石斛等石斛種子在MS、KS、VW、KnudsonC、N6為培養(yǎng)基進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí),得出了硝態(tài)氮遠(yuǎn)高于銨態(tài)氮的N6培養(yǎng)基有利于石斛的萌發(fā)和生長。鄭志仁等利用MS、1/2MS、B5、N6、KC為培養(yǎng)基對鐵皮石斛進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),得到不同的結(jié)論:在MS、1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)率較高,在KC培養(yǎng)基上次之,N6培養(yǎng)基上較低。杜剛等利用VW培養(yǎng)基對鐵皮石斛進(jìn)行誘導(dǎo)也取得了較高的萌發(fā)率。謝啟鑫等利用MS、1/2MS、HyponexNO.1培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),得出1/2MS適合鐵皮石斛的種子培養(yǎng)結(jié)論。曾萬勇等利用WPM、MS、1/2MS和1/3MS培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),在WPM培養(yǎng)基中發(fā)芽率最高,但對MS培養(yǎng)基來說,與謝啟鑫等得出結(jié)論相似:較適宜的培養(yǎng)基為1/3MS和1/2MS,最不適宜的為MS培養(yǎng)基。從曾萬勇、謝啟鑫等研究結(jié)果可得出:在低鹽濃度的培養(yǎng)基中易于誘導(dǎo)鐵皮石斛種子萌發(fā),高鹽離子不利于鐵皮石斛的萌發(fā)與生長。因此在研究及實(shí)際生產(chǎn)中大多采用1/2MS培養(yǎng)基作為種子誘導(dǎo)培養(yǎng)基。1.3激素對鐵皮石斛種子萌發(fā)的影響鐵皮石斛種子在基本培養(yǎng)基上可以萌發(fā),但添加適當(dāng)比例的激素或天然附加物能提高萌發(fā)率,并加快萌發(fā)速度和生長速度。鄭志仁等研究認(rèn)為0.5~1.0mg·L-16-BA對鐵皮石斛種子萌發(fā)有抑制作用,但有促進(jìn)原球莖增殖效果;而0.5~1.0mg·L-1NAA則促進(jìn)鐵皮石斛種子萌發(fā),不僅萌發(fā)率增高,而且萌發(fā)整齊,與曾宋君等結(jié)論相同。李榮珍研究認(rèn)為鐵皮石斛種子萌發(fā)的各種激素影響因子依次為NAA、2,4-D,并得出較適合鐵皮石斛種子萌發(fā)的培養(yǎng)基是1/2MS+NAA0.3mg·L-1+蔗糖30g·L-1。張銘等研究認(rèn)為NAA在0.05~2.0mg·L-1范圍內(nèi)都能促進(jìn)種胚萌發(fā),而2,4-D促進(jìn)種胚萌發(fā)的濃度范圍很窄,僅在濃度為0.5mg·L-1時(shí)能促進(jìn)種胚萌發(fā)。周麗研究認(rèn)為NAA濃度在0.2~0.5mg·L-1最適合胚的萌發(fā)和生長,高于5mg·L-1則起抑制作用;6-BA對胚萌發(fā)后胚狀體的形成和生長有抑制作用,但其用量小且又有NAA存在的情況下能形成胚狀體和分化小芽。杜剛等用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert6.0.6進(jìn)行Simplex-Lattice實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化,得出鐵皮石斛種子萌發(fā)的各種激素影響因子依次為NAA、GA、6-BA,優(yōu)化激素組合為:NAA0.18mg·L-1+6-BA0.53mg·L-1+GA0.28mg·L-1。由此可見,鐵皮石斛種子不需要外源激素即可萌發(fā),單獨(dú)加BA抑制種子萌發(fā),NAA或BA與NAA適宜比例的組合能促進(jìn)其萌發(fā)。通過研究表明,在培養(yǎng)基中添加10%椰子汁、10%馬鈴薯汁等天然營養(yǎng)物質(zhì),對鐵皮石斛種子萌發(fā)和生長都有明顯的促進(jìn)作用。添加適量活性炭可防止褐變,對幼苗成長有利,但對種子萌發(fā)無明顯影響。而楊柳平等則認(rèn)為在培養(yǎng)基中添加天然提取物不利于種子萌發(fā)。2組培快繁的主要形式原球莖繁殖是蘭科植物組織培養(yǎng)的特有現(xiàn)象,是其組培快繁的主要形式。以鐵皮石斛莖尖、莖段、根尖等為外植體誘導(dǎo)原球莖已獲得成功,但選用不同的外植體,所采用的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)效果各有所不同。2.1外植體的選擇2.1.1上誘導(dǎo)對原球莖的誘導(dǎo)莖尖是細(xì)胞分裂最旺盛部分,誘導(dǎo)成功率較高。王春等用鐵皮石斛的莖尖作為外植體,接種1/2MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖,誘導(dǎo)率為58%。張啟香等研究認(rèn)為,以1/2MS為基本培養(yǎng)基有利于原球莖誘導(dǎo),原球莖最優(yōu)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.05mg·L-1+KT0.1mg·L-1+LH1.0g·L-1,并得出土豆汁對原球莖的增殖有很好的促進(jìn)作用的結(jié)論。而溫焱光等采用基本培養(yǎng)基不同,他們將莖尖和腋芽接種于MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1培養(yǎng)基上誘導(dǎo),20d誘導(dǎo)出愈傷組織,2個(gè)月后獲得原球莖。2.1.2最佳培養(yǎng)基的確定鐵皮石斛帶芽莖段取材容易,誘導(dǎo)成功率高,是理想的外植體。常美花等研究認(rèn)為鐵皮石斛帶芽莖段原球莖誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+AC2.0g·L-1;而不加激素的MS培養(yǎng)基鐵皮石斛的原球莖誘導(dǎo)率為0。李丹等研究也認(rèn)為不加激素的MS培養(yǎng)基鐵皮石斛的原球莖誘導(dǎo)率為0,原球莖誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基是MS+KT1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1;NAA是原球莖誘導(dǎo)的關(guān)鍵因子,適宜的KT與NAA配比對原球莖誘導(dǎo)有促進(jìn)作用。蘇鈦等則認(rèn)為NAA并不是原球莖誘導(dǎo)的關(guān)鍵因子,他們用正交設(shè)計(jì)方法對鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)具有影響的激素BA、NAA、KT以及馬鈴薯汁進(jìn)行配比研究,結(jié)果表明:以莖段為外植體在培養(yǎng)基MS+BA2.0mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+馬鈴薯汁10%+糖3%,具有很好的原球莖誘導(dǎo)作用,50d后誘導(dǎo)率達(dá)95.20%;對BA、NAA、馬鈴薯汁進(jìn)行LSD多重比較分析,BA濃度2.0mg·L-1和0.5mg·L-1之間均值差異大,存在顯著差異,而且在濃度2.0mg·L-1時(shí)原球莖誘導(dǎo)率最高。NAA和馬鈴薯汁對誘導(dǎo)率無顯著影響,但是當(dāng)NAA2.0mg·L-1,馬鈴薯汁10%時(shí),誘導(dǎo)的原球莖分化少,原球莖質(zhì)地較好,因此為最佳濃度BA相對于其他激素對鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)效果最好,以2.0mg·L-1BA誘導(dǎo)率最高。2.1.3抗吸能力分離株的獲得再生以鐵皮石斛根尖為外植體誘導(dǎo)原球莖的誘導(dǎo)率相對較低。詹忠根等以鐵皮石斛離體根尖誘導(dǎo)類原球莖表明,外植體在改良B5培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)形成了愈傷組織、類原球莖或直接轉(zhuǎn)化成芽且獲得再生植株。2.2甘蔗的原始繁殖和分解2.2.1最佳培養(yǎng)基的篩選原球莖增殖是鐵皮石斛組織培養(yǎng)過程中一個(gè)十分關(guān)鍵的環(huán)節(jié),通過原球莖增殖,可為之后的分化、壯苗生根奠定基礎(chǔ)。張治國等研究了6種基本培養(yǎng)基(1/2MS、MS、N6、B5、KC、VW)對原球莖增殖的影響,其中1/2MS培養(yǎng)基上的原球莖色淡黃,體積大,無分化且增殖適宜,是適宜鐵皮石斛原球莖增殖的基本培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中不同激素濃度配比對原球莖增殖具有重要影響。楊柳平等通過研究認(rèn)為不同激素配比對原球莖增殖效果不同,NAA、KT、6-BA在適宜的濃度時(shí)對原球莖的增殖起促進(jìn)作用。戴傳云等用正交試驗(yàn)篩選出鐵皮石斛原球莖增殖的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+2.0mg·L-16-BA+0.5mg·L-1NAA+1.0mg·L-1KT;該研究結(jié)果認(rèn)為,在一定范圍內(nèi),在含有高濃度的6-BA和低濃度的NAA的1/2MS培養(yǎng)基上,原球莖增殖系數(shù)大,增殖效果較好;KT在鐵皮石斛原球莖增殖的過程中雖不是必要激素,但加入KT能明顯提高原球莖的增殖速率。張桂芳等認(rèn)為2,4-D對原球莖的生長和增殖不利,一定濃度的BA、KT和NAA有利于原球莖的增殖;KT濃度為1.0mg·L-1時(shí),原球莖40d增殖倍數(shù)最高,達(dá)9.0。2.2.2高濃度細(xì)胞分裂素ba與低濃度生長素naa組合原球莖進(jìn)行分化可形成叢生芽,不同培養(yǎng)基對石斛原球莖分化整齊度、健壯度、分化率影響不一。張治國等研究認(rèn)為,高濃度細(xì)胞分裂素BA與低濃度生長素NAA組合,即2mg·L-16-BA和0.2mg·L-1NAA組合(10∶1),能使原球莖分化的速度加快。邵世光等以N6為基本培養(yǎng)基,激素配比與張治國等相似:2mg·L-16-BA和0.2mg·L-1IBA組合(10∶1),原球莖最易于分化成叢生小苗。2.2.3馬鈴薯汁對原球莖的影響通過研究表明,培養(yǎng)基中添加物不同,原球莖繼代增殖及分化效果也不同。香蕉汁有利于原球莖的繼代增殖,馬鈴薯汁能明顯促進(jìn)原球莖的分化。楊柳平等則認(rèn)為添加蘋果汁對鐵皮石斛原球莖的增殖效果好,土豆汁能有效促進(jìn)鐵皮石斛原球莖的分化,但香蕉汁對原球莖的增殖和分化有抑制作用。蔗糖作為培養(yǎng)基的能源物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)劑,對原球莖的增殖生長影響也較大,3%蔗糖濃度有利于原球莖增殖,而2%蔗糖濃度有利于原球莖分化。2.3植物激素種類的選擇有關(guān)研究表明,一般在不加激素的播種培養(yǎng)基上鐵皮石斛種苗會(huì)自動(dòng)生根,但添加香蕉汁、蔗糖、活性炭等對生根壯苗有明顯促進(jìn)作用,而添加激素對生根影響極大。劉驊等對基本培養(yǎng)基、天然提取物、香蕉提取物濃度和激素種類的選擇進(jìn)行了研究,結(jié)果表明鐵皮石斛壯苗基本培養(yǎng)基以B5或1/2MS為好,天然提取物選用香蕉汁,香蕉汁濃度為10%,植物激素以2mg·L-1的NAA較好。陳兆貴等研究認(rèn)為組培苗的壯苗生根在1/2MS+IBA2.0mg·L-1+水解酪蛋白500mg·L-1+10%香蕉提取液的培養(yǎng)基上效果較好,45d生根率達(dá)92%。3叢生芽的培養(yǎng)以鐵皮石斛帶芽莖段為外植體直接誘導(dǎo)腋芽,再將腋芽培養(yǎng)形成叢生芽是鐵皮石斛快速繁殖的一種新途徑。采用帶芽莖段離體培養(yǎng)叢生芽,不經(jīng)過愈傷組織階段,能直接萌發(fā)出芽,有利于保持該品種遺傳性狀穩(wěn)定。在外植體選擇方面上,李進(jìn)進(jìn)研究認(rèn)為,選用一年生嫩莖中部莖段誘導(dǎo)培養(yǎng),產(chǎn)生的叢生芽數(shù)量多,芽的平均長度長而且生長良好。朱艷等以鐵皮石斛的莖段作外植體,比較不同的培養(yǎng)基、激素等因素對莖段分化叢生芽的影響,以及不同濃度的香蕉汁和活性炭對試管苗生根的影響。研究結(jié)果表明:1/2MS較好,BA作用優(yōu)于KT、ZT,最適濃度為2.0mg·L-1;叢生芽培養(yǎng)于1/2MS+10%香蕉汁+0.5%AC的培養(yǎng)基上,生根效果最好。這與郭洪波等研究結(jié)果有所不同,郭洪波等研究認(rèn)為,外植體在MS+6-BA5.0mg·L-1+NAA(0~0.8mg·L-1)上誘導(dǎo)叢生芽最好,誘導(dǎo)率高達(dá)93.33%,增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA5.0mg·L-1+NAA0.4mg·L-1+20%香蕉汁。洪森榮等研究認(rèn)為,不添加任何植物激素的MS對鐵皮石斛帶芽莖段根的分化最為有利,但添加了KT和NAA后,對芽的分化有促進(jìn)作用,細(xì)胞分裂素KT與生長素NAA配比高的培養(yǎng)基,繁殖系數(shù)高,反之繁殖系數(shù)低。4激素對鐵皮石斛花芽形成的調(diào)控在離體培養(yǎng)條件下,鐵皮石斛可在試管、廣口瓶等培養(yǎng)容器中開花。王光遠(yuǎn)等研究了多種植物激素和多胺對鐵皮石斛組織培養(yǎng)中花芽形成的影響,表明在培養(yǎng)基中加入合適濃度的亞精胺或BA,或同時(shí)加入NAA和BA均可誘導(dǎo)原球莖或由之形成的無根小苗在3~6個(gè)月開花,頻率在31.6~45.8%之間。當(dāng)將原球莖在加有ABA的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)后再移到加有BA的培養(yǎng)基上,花芽形成的頻率可提高到82.8%(個(gè)別實(shí)驗(yàn)中可達(dá)100%)。周麗將3個(gè)月苗齡的組培苗在KaudsonC+2,4-D0.2mg·L-1+ZT0.6mg·L-1的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)2個(gè)月后,可誘導(dǎo)出一定數(shù)量的花芽,然后轉(zhuǎn)接于KaudsonC+香蕉提取物100g·L-1的無激素的培養(yǎng)基上可正常開花,花大且形態(tài)正常,花期3周左右。岑秀芬等研究了激素因子對鐵皮石斛離體培養(yǎng)開花誘導(dǎo)的效應(yīng),表明PP3330.3mg·L-1+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+TDZ0.06mg·L-1為適宜的激素組合,其花芽形成率和花開放率高達(dá)80.4%和90.3%。通過離體開花技術(shù)可制作成鐵皮石斛微型觀賞品,具有運(yùn)輸方便、無需管理等優(yōu)勢。由于組織培養(yǎng)過程中有一定的變異率,可通過離體開花篩選新的花型,通過雜交可進(jìn)一步培育株型高大、兼具藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值的優(yōu)良石斛品種。5人工種子和胚胎血漿資源的保存鐵皮石斛自然條件下種子萌發(fā)率極低,通過人工種子或低溫等處理,可有效保存并開發(fā)種質(zhì)資源。5.1炭或淀粉添加量郭順星等以原球莖為材料,以改良1/2MS培養(yǎng)基各種成分附加蔗糖為人工胚乳,初步建立了鐵皮石斛人工種子制作流程。張銘等應(yīng)用粘土和蛭石粉作基質(zhì)包埋鐵皮石斛種胚來制作人工種子,當(dāng)粘土∶蛭石粉∶MS培養(yǎng)液為2∶1∶2時(shí)萌發(fā)率可達(dá)56.8%。在此系統(tǒng)中單獨(dú)添加1.0%活性炭或同時(shí)添加1.0%活性炭和0.5%淀粉制作的鐵皮石斛人工種子,平均萌發(fā)率分別達(dá)76.7%和80.3%。張桂芳等對人工種子制作及影響因素進(jìn)行了研究,表明以MS+0.5mg·L-1BA+0.5mg·L-1NAA+3g·L-1AC+30g·L-1海藻酸鈉+3g·L-1百菌清為基本胚乳,在2%CaCl2中反應(yīng)15min是鐵皮石斛人工種子制作的較佳條件,胚乳中分別添加15g·L-1木薯淀粉和10g·L-1保水劑能明顯提高人工種子的萌發(fā)率和成苗率,種皮中添加10L納米SiO2和10L納米TiO2均能明顯提高萌發(fā)率,但添加10L納米SiO2成苗率最高。曾穎蘋等進(jìn)行了鐵皮石斛人工種子包衣技術(shù)研究,表明以萌發(fā)原球莖為繁殖體的人工種子萌發(fā)率和成活率較高,適宜的人工胚乳組合為蔗糖3.0%、ABA1.0mg·L-1、活性炭濃度0.5%、多菌靈3.0%、海藻酸鈉3.0%。5.2超低溫保存研究史永忠等將鐵皮石斛試管苗培養(yǎng)在1/2MS,附加0.5mg·L-1NAA、20mg·L-1蔗糖、0.5g·L-1活性炭和7g·L-1瓊脂的培養(yǎng)基上,室溫條件下連續(xù)保存12個(gè)月,存活率達(dá)100%。王君暉等用液氮對鐵皮石斛的種子、原球莖和類原球莖體進(jìn)行了超低溫保存研究,表明把4個(gè)月齡的種子脫水至含水量為12~19%,能獲得較高的凍后存活率(95%)和較快的恢復(fù)生長速率;原球莖用玻璃化保護(hù)劑PVS2處理15min,其凍后存活率可達(dá)88%;類原球莖的含水量在6~7d內(nèi)干燥至30±2%,其凍后存活率可達(dá)48~80%。陳勇等對鐵皮石斛的原生質(zhì)體、原球莖進(jìn)行了玻璃化法超低溫保存研究,存活率分別達(dá)48%和88%。林偉強(qiáng)等用空氣干燥法成功地凍存了鐵皮石斛的種子及初生原球莖。羅吉鳳等研究表明離體保存材料可采用試管叢芽和原球莖兩種方式,以保持其遺傳多樣性。保存方法是:在15℃左右條件下,保存離體材料,繼代間隔期為12~18個(gè)月;也可以采用室溫保存,在1/2MS+蔗糖1%培養(yǎng)基上,繼代間隔期可延長至10~12個(gè)月。6鐵皮石斛的誘導(dǎo)與二倍體