分子診斷學(xué)：試題-第十二章

第十二章其它的分子診斷檢測方法試題一、A型題1．PCR擴增阻礙突變系統(tǒng)檢測突變的原理是基于A由于突變，限制性內(nèi)切酶識別位點變化，不能被切開B由于突變，電泳遷移率發(fā)生變化C連接酶不能連接與靶序列錯配的兩個DNA片段DTaq酶不能延伸3’末端與靶序列錯配的引物E以上都不是2．利用寡核苷酸連接實驗檢測雙等位基因變異時需要A1個探針B2個探針C3個探針D4個探針E5個探針3．T4DNA連接酶或TthDNA連接酶更容易識別哪類錯配A連接缺口上游探針的5’末端B連接缺口上游探針的3’末端C連接缺口下游探針的5’末端D連接缺口下游探針的3’末端E以上都不是4．溫度梯度凝膠電泳能夠檢測的突變一般位于DNA片段上哪個區(qū)域A較低解鏈溫度的“解鏈區(qū)域”B最低解鏈溫度的“解鏈區(qū)域”C較高解鏈溫度的“解鏈區(qū)域”D最高解鏈溫度的“解鏈區(qū)域”E所有位點5．溫度梯度凝膠電泳與變性梯度凝膠電泳檢測基因變異是基于A變異單鏈DNA分子的電泳遷移率不同B變異DNA雙鏈分子的電泳遷移率不同C變異雙鏈DNA分子部分變性的條件不同，電泳遷移率改變的位置不同D變異雙鏈DNA分子完全變性的條件不同，電泳遷移率改變的位置不同E變異雙鏈DNA分子完全變性的條件不同，電泳遷移率不同6．蛋白質(zhì)截短測試法與其它分子檢測方法最大的不同在于A只檢測單位點突變B只檢測已知突變C只檢測與疾病相關(guān)的突變D可檢測未知突變E可檢測多位點突變二、X型題1．PCR擴增阻礙突變系統(tǒng)檢測可用于哪些類型的分子檢測A單位點突變B多位點突變C未知突變D基因分型E以上都可以2．耐熱連接酶的使用，可增加寡核苷酸連接實驗的A靈敏度B重現(xiàn)性C特異性D假陽性E假陰性3．變性高效液相色譜法可分離A單鏈DNA分子B雙鏈DNA分子C環(huán)狀DNA分子D超螺旋DNA分子E部分雙鏈DNA分子4．脈沖場凝膠電泳與傳統(tǒng)凝膠電泳的不同點有A采用的凝膠基質(zhì)不同B采用的電場類型不同C采用的電泳儀裝置不同D分辨的DNA片段大小不同E樣品的制備不同5．下列哪些技術(shù)屬于分子影像技術(shù)AUltrasoundBSPECTCMRIDCTEPET三、名詞解釋1．解鏈區(qū)域2．變性高效液相色譜法3．倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳（Field-InversionGelElectrophoresis,FIGE）4．旋轉(zhuǎn)凝膠電泳（RotatingGelElectrophoresis,RGE）5．分子影像探針四、問答題1．簡述TGGE/DGGE的基本原理2．簡述變性高效液相色譜法檢測基因變異的優(yōu)點3．試述PTT檢測基因變異的優(yōu)缺點4．簡述PFGE的基本原理5．簡述分子影像在分子診斷中的應(yīng)用6．簡述常用的光學(xué)成像技術(shù)第十章核酸測序技術(shù)試題答案一、A型題1.D2.C3.B4.A5.D6.C二、X型題1.ABD2.AC3.ABE4.BCDE5.BCE

三、名詞解釋解鏈區(qū)域答：一個DNA分子一般含有多個“解鏈區(qū)域”，一個“解鏈區(qū)域”長大約50－300bp不等，每一個“解鏈區(qū)域”內(nèi)的所有核苷酸在其相應(yīng)的Tm范圍內(nèi)以“全或無”的方式發(fā)生解離。在進行TGGE時，當DNA分子到達其第一個“解鏈區(qū)域”的解鏈溫度時，分子的電泳遷移率將急劇降低。若該區(qū)域有堿基突變，突變將改變這一“解鏈區(qū)域”的Tm，因此，同時進行TGGE時，由于變異分子的第一個“解鏈區(qū)域”Tm不同，其電泳遷移率改變的凝膠位置不同，可形成不同的條帶，從而可分辨出基因的變異。變性高效液相色譜法答：DHPLC的填料由一個具有惰性物化性質(zhì)的固定相和PS-DVB微孔球共價連接而成，采用具有疏水性的又帶正電荷的TEAA作為“橋分子”，使DNA片段能夠被吸附在固定相上。DHPLC的流動相為有機溶劑乙氰，雙鏈DNA分子被吸附在固定相上，通過改變流動相中乙氰的濃度，不同片段長度的DNA分子被逐步洗脫，從而實現(xiàn)DNA片段的分離。洗脫下來的DNA片段一般通過紫外檢測，波長254nm，而不需要進行費時的凝膠電泳分析。當柱溫<50℃時，根據(jù)雙鏈DNA分子的鏈長度來的分離。當70℃>柱溫>50℃時，根據(jù)雙鏈分子的序列進行分離，這時可用于雜合雙鏈分子與純合雙鏈分子的分離。當柱溫>70℃時，依據(jù)單鏈DNA分子的堿基組成和片段長短進行分離。倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳（Field-InversionGelElectrophoresis,FIGE）答：FIGE的兩個電場方向為180°反轉(zhuǎn)。電場的方向間隔一定時間交換，驅(qū)動DNA分子向前遷移的正向脈沖時間較反向的長一些，這樣DNA分子的總遷移為向前。其時間比例為向前：向后＝3：1。在FIGE試驗中通過持續(xù)改變脈沖時程，利用簡單的裝置可就可得到分離很好的電泳條帶，所需的僅為標準的凝膠電泳槽和一個脈沖電極控制器。目前FIGE已非常流行于較小片段的分離，分離的片段最大為800kb（600－750kb）。旋轉(zhuǎn)凝膠電泳（RotatingGelElectrophoresis,RGE）答：RGE采用一個單獨的均一電場，只是通過周期性的旋轉(zhuǎn)凝膠而使得電場方向相對改變，從而使DNA分子也是在周期性改變的電場中泳動，其分離原理與其它的PFGE一樣。在RGE中，驟變脈沖時間和電壓很容易，因而可以用于研究不同電場角度時這些參數(shù)對DNA分離效果的影響。通過適當調(diào)節(jié)凝膠旋轉(zhuǎn)頻率，RGE可分離50－6,000kb的DNA分子。分子影像探針答：分子探針是分子影像中的關(guān)鍵組成部分，高度特異性的分子探針是進行分子影像學(xué)研究的先決條件，常用的示蹤劑為有核素、順磁性物質(zhì)或熒光素等，應(yīng)具備下列特點：（1）分子量小、純度高、安全，不影響所研究的疾病過程。（2）具有良好的生物學(xué)功能，能參與人體正常的生理生化活動。（3）能夠克服人體內(nèi)部的“生理屏障”（如腦屏障、血管壁、細胞膜等），順利到達靶分子所在的器官，同時不會積聚于其他組織。（4）示蹤劑、分子探針和靶分子應(yīng)該緊密結(jié)合，不能脫落，且有足夠長的半衰期以便于檢測。四、問答題簡述TGGE/DGGE的基本原理答：在TGGE中，隨著溫度的逐漸升高時，DNA分子會呈階梯式逐步發(fā)生解鏈。部分解鏈的雙鏈DNA分子表現(xiàn)出一種復(fù)雜的分枝構(gòu)像，使得其電泳遷移率大大下降。DNA分子的解鏈決定于該分子的解鏈溫度（Tm），而Tm有強烈的序列依賴性，如在單取代突變中，若是A:T（兩個氫鍵）被G:C（三個氫鍵）取代，將增加該雙鏈DNA分子的Tm值。而整個DNA分子序列對解鏈溫度也有影響，若A:T被T:A替代，或G:C被C:G替代，分子的解鏈溫度也會發(fā)生改變。因此不同的DNA分子由于其Tm不同，將于不同凝膠位置（溫度不同）產(chǎn)生分枝（解離）使電泳遷移率降低，從而在凝膠上的不同位置形成條帶。DGGE的變性條件為熱（一般為60℃的恒定溫度）和固定比率的甲酰胺（0－40％）、尿素（0－7M）。這些梯度變性的功能就相當于TGGE中的溫度梯度的功能，使不同DNA分子在不同的凝膠部位發(fā)生解鏈，引起遷移率下降，從而將不同的DNA分子分離。簡述變性高效液相色譜法檢測基因變異的優(yōu)點答：DHPLC突變檢測技術(shù)與其它方法相比，具有更高的準確性和敏感性。（1）DHPLC與各種電泳法的比較SSCP分析片段長度<300bp，對于人類SNP的檢出率為50～95％，尤其容易漏檢位于發(fā)夾結(jié)構(gòu)中的變異。CSGE檢測雜合子的靈敏度與SSCP相當或稍低。而DHPLC對150bp~600bp的DNA片段的突變檢出率都可達到100％，且而不需要特殊的樣本處理。TGGE/DGGE對于異源雙鏈及同源雙鏈分子的檢測靈敏度高出CSGE和SSCP很多。但對于較高溫度的融解區(qū)域的突變檢測，DHPLC的靈敏度要高于TGGE/DGGE。（2）DHPLC與DNA測序的比較對于頻率高于20%的變異，直接測序的檢出率為80％，DHPLC的檢出率可達到100％；基因突變頻率低于20%時就很難用測序方法檢測到，而DHPLC可從待檢樣品中檢測到占總基因量0.5-5%的突變等位基因，且重現(xiàn)性很好。試述PTT檢測基因變異的優(yōu)缺點答：PTT檢測突變的優(yōu)點：①能檢測出只與疾病相關(guān)的蛋白截短突變；②可檢測出在RNA形成過程中發(fā)生的突變（如剪接突變）；③通過只鑒定引起疾病截短突變，PTT分析不會受到基因沉默變異如多態(tài)性的妨礙；④截短蛋白分子的長度指明了突變的位置，因此更方便進行測序分析以確定突變。PPT檢測突變的缺點：①由于PCR擴增效率的影響，對于包含幾千個核苷酸序列多個外顯子的疾病基因，就需要分成幾個1－2kb的片段分別擴增，分別進行PTT檢測；②由于微小缺失/插入突變對蛋白產(chǎn)物分子大小影響太小，凝膠不能分辯，因而檢測不出編碼序列中小的插入或缺失或是錯義突變；③引起RNA產(chǎn)量改變或使mRNA不穩(wěn)定的突變可能被漏檢。簡述PFGE的基本原理答：PFGE采用一種正交的交變脈沖電場，在進行瓊脂糖凝膠電泳時，其方向、脈沖時間和電壓大小可交替改變。在每次電場方向改變時，DNA分子就要有一定的時間改變形狀和遷移方向，只有當DNA分子達到一定構(gòu)型，沿新的泳動方面伸直后，才能向前遷移。DNA分子的轉(zhuǎn)向時間與其大小關(guān)系極為密切，分子越大，分子構(gòu)型轉(zhuǎn)換所需時間就越長，轉(zhuǎn)變遷移方向的時間也就越長。對于不同大小的DNA大分子，其改變泳動方向所需的時間不等，遷移速度的快慢也就不等，因此就可以按DNA分子量大小使其分離開來。根據(jù)欲分離的DNA分子大小適當調(diào)節(jié)電場方向的相交角度、電壓及脈沖時間等參數(shù)，即可將各種分子量大小不同的分子分開。簡述分子影像在分子診斷中的應(yīng)用答：分子影像可特異靈敏地探查疾病過程中相關(guān)分子的異常，能夠提高臨床診治疾病的水平，在臨床上有良好的應(yīng)用前景。但其在分子診斷中的應(yīng)用剛剛起步，主要集中于腫瘤、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)三大領(lǐng)域。目前臨床診斷中應(yīng)用最多的是對腫瘤的臨床檢查，占臨床檢查總數(shù)的85%左右。有資料證實，PET可以使早期腫瘤的診斷率提高30％～40％。除了早期診斷，分子影像技術(shù)還可對腫瘤進行分期、分型，提示腫瘤的惡性程度和預(yù)后。分子影像在心血管系統(tǒng)疾病診斷則主要是關(guān)于心肌存活性對于心臟功能判斷、臨床治療方案選擇及心功能預(yù)后分析。對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷多采用放射性核素成像系統(tǒng)對神經(jīng)系統(tǒng)進行受體顯像，可同時觀察受體的分布和密度，為臨床提供定量的檢測數(shù)據(jù)。6．簡述常用的光學(xué)成像技術(shù)答：目前的光學(xué)成像技術(shù)主要包括熒光（fluorescence）和生物發(fā)光（bioluminescence）兩種技術(shù)。熒光成像技術(shù)常用GFP、RFP及等近紅外線（NIR）熒光素基因為報告基因。NIR熒光素是目前熒光成像研究的熱點。將NIR熒光素與傳送載體通過一段蛋白酶特異性肽段連接起來就形成了NIR探針。在原始狀態(tài)由于存在熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用，NIR熒光素不發(fā)出熒光信號。當出現(xiàn)靶向蛋白水解酶將特異性肽底物降解時，熒光素與傳送載體分離，熒光淬滅作用消失，NIR熒光素即釋放出高達幾百倍的熒光。通過這類探針能活體無創(chuàng)性檢測多種蛋白酶的活性及疾病早期的病理現(xiàn)象，還能評價治療效果