玻璃化冷凍技術(shù)對大鼠卵巢組織的保護(hù)作用

玻璃化冷凍技術(shù)對大鼠卵巢組織的保護(hù)作用

0不同冷凍方式下卵巢組織冷凍在動物方面，動物的卵組織可以通過冷凍保存，為良種動物、稀有動物和危險動物建立種子數(shù)據(jù)庫。在人類,可以為某些患良性及惡性腫瘤的女性患者保存生殖能力,有效治療卵巢內(nèi)分泌不足、恢復(fù)正常月經(jīng)周期、并可能自然妊娠;推遲女性絕經(jīng)期的到來,從而提高中老年女性的生活質(zhì)量。目前,卵巢組織冷凍程序主要有快速冷凍、慢速冷凍和玻璃化冷凍法。慢速冷凍需要程序化冷凍儀,雖凍存效果好,但需要特殊設(shè)備,且操作過程相對復(fù)雜;快速冷凍不需要程序冷凍儀,簡便易行,但是較難控制,對卵巢組織損傷大;玻璃化冷凍是一種比較新的冷凍方法,應(yīng)用高濃度的冷凍保護(hù)液結(jié)合極快的制冷速度,使細(xì)胞快速冷凍,避免細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成對細(xì)胞的破壞作用,具有操作簡單、冷凍效率高的特點,因此在卵巢的冷凍保存中日益受到重視。本實驗采用玻璃化冷凍技術(shù)冷凍大鼠卵巢組織,比較4種冷凍保護(hù)劑對大鼠卵巢組織學(xué)和功能的影響,旨在尋求冷凍效果最佳的玻璃化冷凍保護(hù)劑,為人類卵巢組織冷凍研究提供實驗依據(jù)。1組織病理學(xué)檢查設(shè)計:隨機(jī)分組動物實驗,卵巢組織對比觀察。時間及地點:于2008-07/2009-01在吉林醫(yī)藥學(xué)院完成。材料:清潔級健康未交配成年雌性Wistar大鼠36只,體質(zhì)量220～250g,購自長春高新實驗動物研究所。隨機(jī)數(shù)字表法分為6組,每組6只:二甲基亞砜+乙二醇組、二甲基亞砜+乙二醇+蔗糖組、二甲基亞砜+乙二醇+蔗糖+乙酰胺組、乙二醇+蔗糖+乙酰胺組、去勢組(切除雙側(cè)卵巢,未移植)、正常對照組。實驗過程中對動物處置符合科學(xué)技術(shù)部2006年《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的要求。實驗方法:手術(shù)摘取卵巢:10%水合氯醛0.3μL/g腹腔注射麻醉大鼠,固定后常規(guī)消毒,剪開背部腰椎兩側(cè)皮膚及肌肉,從卵巢囊內(nèi)完整剝離雙側(cè)卵巢,置于加有RPMI1640的小培養(yǎng)皿中,修剪其周圍組織,盡量去除髓質(zhì),然后切成約1mm3大小的組織塊,分別采用4種冷凍保護(hù)液凍存卵巢組織。大鼠術(shù)后消毒手術(shù)創(chuàng)口,肌注青霉素,2次/d,注射7d。去勢組摘除卵巢后不冷凍、不移植,作為無卵巢比較組,旨在觀測實驗過程中卵巢摘除的是否徹底,正常對照組不作處理。冷凍及復(fù)蘇:參照文后文獻(xiàn)[14-17]進(jìn)行,略有改動,大致如下:將4冷凍組大鼠處理好的卵巢組織分別放入相應(yīng)的平衡液中4℃滲透平衡15min,然后再轉(zhuǎn)移到各自的冷凍保護(hù)液中置4℃繼續(xù)滲透平衡15min,裝入1.8mL冷凍管中置液氮口處繼續(xù)滲透30min,投入液氮中保存。卵巢組織凍存2周后,將冷凍管從液氮罐中取出,迅速置于37℃水浴,待冰晶融化后移入含0.5mol/LS、體積分?jǐn)?shù)20%FCS的RPMI1640基質(zhì)液中平衡5min,RPMI1640沖洗3遍,移入含體積分?jǐn)?shù)20%FCS的RPMI1640中備移植用。大鼠自體異位移植卵巢組織:雙側(cè)卵巢切除后2周,陰道細(xì)胞學(xué)檢查證實去勢徹底者,在后肢大腿內(nèi)側(cè)作一平行于大腿縱軸的皮膚切口,將解凍復(fù)蘇的卵巢組織塊置于深筋膜與肌膜之間。術(shù)后消毒切口,肌注青霉素。大鼠一般狀態(tài):術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng),每日觀察動物飲食、活動、毛發(fā)等,并記錄。陰道上皮類型及動情周期觀察:移植后30d開始,通過陰道涂片觀察脫落細(xì)胞類型,出現(xiàn)動情周期者,其分期依據(jù)陰道上皮細(xì)胞類型判定;未出現(xiàn)動情周期者,觀察角化細(xì)胞,若角化細(xì)胞大于50%則認(rèn)為有雌激素樣效應(yīng)。解凍復(fù)蘇后卵巢組織的形態(tài)學(xué)觀察:蘇木精-伊紅染色后光鏡下觀察各級卵泡及卵巢組織結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)特點,計數(shù)正常形態(tài)及異常形態(tài)的原始卵泡、初級卵泡。血清雌激素水平測定:移植后3個月,20%烏拉坦5mL/kg腹腔注射麻醉,開腹采用腹主動脈法采血,室溫放置30mim后,3000r/min離心收集血清,放射免疫法測雌二醇水平。移植物組織形態(tài)學(xué)檢測:腹主動脈采血后,取出移植物,大體觀察其形態(tài)、大小及血供。甲醛固定,石蠟包埋,4μm連續(xù)切片,蘇木精-伊紅染色,觀察卵泡發(fā)育情況及形態(tài)結(jié)構(gòu)。主要觀察指標(biāo):解凍復(fù)蘇后卵巢組織形態(tài)學(xué)變化。陰道上皮類型及動情周期。血清雌二醇水平。回收卵巢組織學(xué)檢查。設(shè)計、實施、評估者:設(shè)計及實施由全體作者完成,評估由通訊作者完成,均經(jīng)過系統(tǒng)訓(xùn)練,未使用盲法評估。統(tǒng)計學(xué)分析:由第一作者采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理,形態(tài)學(xué)比較采用χ2檢驗,雌二醇水平比較采用t檢驗。2結(jié)果2.1動物的一般狀態(tài)觀察所有大鼠移植后生存狀況良好,活動、攝食正常,手術(shù)切口無感染,均進(jìn)入結(jié)果分析。2.2動情周期去勢組陰道上皮呈持續(xù)性無角化,可見白細(xì)胞及少量黏液;正常對照組顯示規(guī)律的動情周期;4凍存組均未出現(xiàn)典型動情周期的細(xì)胞類型,但角化細(xì)胞逐漸增多,二甲基亞砜+乙二醇+蔗糖組、二甲基亞砜+乙二醇+蔗糖+乙酰胺組平均角化細(xì)胞達(dá)到75%,二甲基亞砜+乙二醇組為55%,乙二醇+蔗糖+乙酰胺組為51%。2.3不同發(fā)育階段發(fā)育階段發(fā)育階段發(fā)生情況比較4種冷凍方法中均可見卵巢組織結(jié)構(gòu)受損的表現(xiàn),4冷凍組原始卵泡及初級卵泡形態(tài)正常率見表1。正常率為二甲基亞砜+乙二醇+蔗糖+乙酰胺組最高,與二甲基亞砜+乙二醇組、乙二醇+蔗糖+乙酰胺組比較,差異有顯著性意義(P<0.05);不同發(fā)育階段卵泡構(gòu)成比差異無顯著性意義,均未見典型的次級卵泡。受損的卵細(xì)胞主要表現(xiàn)為體積變小、胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡、核皺縮等。同時卵細(xì)胞與周圍的顆粒細(xì)胞之間形成較大的空隙;部分組織塊間質(zhì)組織比較疏松,卵泡周圍基質(zhì)細(xì)胞和膠原纖維素失去正常卵巢組織的致密性,見圖1。2.5組大鼠血清中二甲基亞、二甲基亞、乙二醇、蔗糖、乙酰胺、乙酰胺的含量比較表1移植后3個月,各組大鼠血清雌二醇水平見表2。4組冷凍組雌二醇水平均明顯低于正常對照組(P<0.01),二甲基亞砜+乙二醇組、二甲基亞砜+乙二醇+蔗糖組比較,差異無顯著性意義,二甲基亞砜+乙二醇+蔗糖+乙酰胺組與其他冷凍組比較,差異有顯著性意義(P<0.05)。3不同保護(hù)劑對大鼠卵細(xì)胞的影響惡性腫瘤日益成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一,特別對于年輕女性患者,接受根治性手術(shù)治療(如切除卵巢等)或大劑量放療、化療等都會不同程度導(dǎo)致性腺功能的破壞甚至喪失,破壞生殖能力。因此,卵巢移植治療成為研究的熱點。卵巢組織冷凍保存可為患有惡性腫瘤的女性提供生殖保險。隨著冷凍和移植技術(shù)的不斷發(fā)展,冷凍保存技術(shù)日益成為人們關(guān)注的焦點。研究人員證實,在人類及哺乳動物體內(nèi)移植凍融卵巢組織后,卵巢能恢復(fù)分泌功能和生殖能力。卵巢組織的凍存與移植是將來保存某些女性患者生育能力最有希望的方法。實驗采用4種玻璃化冷凍保護(hù)劑凍存大鼠卵巢組織2周后,觀察其卵細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu),并進(jìn)行同體異位移植,觀察移植物及測定血清雌二醇水平,判斷移植物活力。結(jié)果顯示,冷凍后復(fù)蘇的卵巢組織均有一定程度的損傷,4種凍存方法原始卵泡的正常率分別為67.9%、71.6%、80.5%、59.4%,而初級卵泡形態(tài)正常率則分別為41.6%、52.3%、55.9%、36.7%,說明凍存卵巢組織初級卵泡的損傷大于原始卵泡,可能與初級卵泡較原始卵泡代謝率高、對冷凍降溫敏感的顆粒細(xì)胞增多增大有關(guān)。在4種冷凍保護(hù)液中,二甲基亞砜+乙二醇+蔗糖+乙酰胺組正常卵泡數(shù)量最多,并且與移植后大鼠血清雌二醇水平一致,說明聯(lián)合應(yīng)用滲透性保護(hù)劑(二甲基亞砜、乙二醇)、非滲透性保護(hù)劑(蔗糖)和保護(hù)劑毒性中和劑(乙酰胺)是一種理想的玻璃化冷凍劑。陰道上皮細(xì)胞和子宮內(nèi)膜細(xì)胞作為卵巢激素的靶細(xì)胞,對雌激素高度敏感。移植后陰道上皮細(xì)胞持續(xù)角化,血清雌二醇水平明顯高于同期的去勢組,說明卵巢功能開始恢復(fù)。但移植組動物沒有出現(xiàn)規(guī)律的動情周期,且血清雌二醇水平與正常對照組相比明顯降低,說明卵巢功能雖有恢復(fù),但并不完全。研究表明,卵巢組織冷凍效果受多種因素影響,如解凍、平衡、組織塊大小等,而移植效果除與上述因素有關(guān)外,還與移植部位的選擇密切相關(guān),因此完善的卵巢組織凍存移植方案尚需進(jìn)一步深入探討與研究。主要試劑及設(shè)備:主要試劑配制:冷凍保護(hù)液及平衡液均以RPMI1640為基液配制,保護(hù)液均含體積分?jǐn)?shù)20