紫杉醇及紫杉烷的研究進(jìn)展

紫杉醇及紫杉烷的研究進(jìn)展

0杉烷醇的應(yīng)用紫杉醇是一種重要的抗高血壓藥物。紫杉醇是紫色醇代謝前和支代謝產(chǎn)物。一些紫杉醇具有特殊的生理活性。紫杉醇及紫杉烷的產(chǎn)量低一直是制約其應(yīng)用的主要瓶頸,如何擴(kuò)大藥源是一直以來面臨的難題。已經(jīng)開發(fā)出一些生產(chǎn)紫杉醇及紫杉烷的技術(shù),其中植物細(xì)胞工程方法因?yàn)椴徽加酶?環(huán)境友好,可調(diào)控,符合可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略而受到普遍的重視。1紫杉醇和紫杉烷1.1“紫杉醇”致刑事訴訟1963年,Wall發(fā)現(xiàn)短葉紅豆杉(Taxusbrevifolia)樹皮提取物具有抗腫瘤活性。1967年,Wall和Wani分離出紫杉醇(paclitaxel),1971年,通過X射線衍射和核磁技術(shù)解析了紫杉醇的結(jié)構(gòu)。1979年,Horwitz揭示了紫杉醇抗腫瘤的機(jī)制:它可以穩(wěn)定微管的聚集并防止微管正常的生理解聚,對于增殖速度極快的腫瘤細(xì)胞,它可“凍結(jié)”有絲分裂的紡錘體,從而使腫瘤細(xì)胞分裂停止在G2和M,直到死亡。紫杉醇是發(fā)現(xiàn)的第一個促進(jìn)微管聚合的藥物。1984年和1985年分別進(jìn)行了紫杉醇的一期和二期臨床試驗(yàn)。在1989年和1991年,分別發(fā)現(xiàn)了紫杉醇抑制卵巢癌和乳腺癌的顯著活性。美國食品藥品管理局(FDI)在1992年和1994年批準(zhǔn)紫杉醇為治療卵巢癌和乳腺癌的臨床藥物。1993年,百時美施貴寶公司(Bristol-MyersSquibbCompany)以Taxol?為商標(biāo)將紫杉醇投入市場。2000年,銷售額已達(dá)16億美元。現(xiàn)在,紫杉醇和其半合成衍生物多烯紫杉醇docetaxel(紫杉替爾,Taxotere)已經(jīng)成為臨床治療卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌的一線藥物。此外,紫杉醇及多烯紫杉醇還用于治療肺癌、卡波西肉瘤、結(jié)腸癌、黑素瘤以及淋巴瘤。紫杉醇作為紅豆杉科紅豆杉屬植物的主要次生代謝產(chǎn)物,主要存在于樹皮及針葉中。化學(xué)結(jié)構(gòu)分為2個部分(圖1):基本骨架為一個紫杉烷(taxane)類的三環(huán)二萜,側(cè)鏈包括3個芳香環(huán)(1個苯環(huán),2個苯甲酰環(huán))和1個環(huán)氧丙烷環(huán)(D環(huán)),合起來有7個環(huán),其核心為四環(huán)二萜。其分子式為C14H51NO14,分子量為853.92。1.2紫杉烷的骨架紫杉醇抗癌活性的發(fā)現(xiàn)激勵人們?nèi)シ蛛x更多其他紫杉烷類化合物,以期找到具有更好活性的化合物。第1個紫杉堿由Lucas在1856年發(fā)現(xiàn),到1999年已鑒定結(jié)構(gòu)的紫杉烷二萜化合物超過350種。絕大多數(shù)紫杉烷化合物含有苯甲基三環(huán)十五烷骨架,即紫杉烷骨架。近年來發(fā)現(xiàn)的其他骨架均是這一基本骨架的重排,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多紫杉烷具有特殊的生理活性,比如最初從云南紅豆杉(Taxusyunnanensis)的根中提取得到的云南紫杉烷C-Tc(TaxuyunnanineC)是一種具有類神經(jīng)生長因子(NGF)活性的化合物,能夠強(qiáng)化NGF的作用,有利于老年癡呆癥(Alzheimer’sdisease)的治療。2紫杉醇的生產(chǎn)紫杉醇最初從短葉紅豆杉樹皮中提取,含量僅有萬分之幾,1kg紫杉醇需要2000~3000棵短葉紅豆杉的樹皮或10余噸枝葉。紫杉醇供給問題引起了廣泛關(guān)注,資源不足成為制約紫杉醇臨床應(yīng)用的主要因素。盡管Holton和Nicolaou研究小組在1994年分別獨(dú)立全合成了紫杉醇,之后又有許多不同途徑成功合成了紫杉醇,但都因步驟繁瑣,產(chǎn)率低而無法工業(yè)化。美國國立癌癥研究所(NCI)授權(quán)百時美施貴寶公司解決藥源問題,開發(fā)的藥源有:由紅豆杉可再生的枝葉中提取;由提取的紫杉烯半合成紫杉醇;由植物組織培養(yǎng)獲得。一個重大突破是Potier發(fā)現(xiàn)漿果紅豆杉(Taxusbaccata)針葉中含有10-去乙?；涂ㄍII(10-deacetylbaccatinIII,10-DAB)和巴卡亭III(baccatinIII)。Holton的研究團(tuán)隊(duì)由10-去乙?；涂ㄍII(在各種紅豆杉植物中均含有,由可再生的枝葉中提取)開始,經(jīng)過4步反應(yīng),合成紫杉醇,由此向臨床供給了大量紫杉醇。紫杉醇的銷售額由1994年的4億美元增長為2000年的16億美元。目前市售的紫杉醇按原料來源不同分為2類:一類是直接從紅豆杉植物中提取;另一類為半合成紫杉醇,即從紅豆杉嫩枝條或樹葉等可再生資源中提取10-去乙酰巴卡亭III,或用提取紫杉醇過程中的副產(chǎn)物如7-木糖、10-去乙酰紫杉醇、三尖杉寧堿等為原料經(jīng)化學(xué)半合成生產(chǎn)紫杉醇或多烯紫杉醇。但半合成方法有環(huán)境污染問題,由原植物中提取加工通常以理化方法為主,該方法破壞資源、不利于環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展。雖然1993年Stierle等報道在真菌Taxomycesandreanae中發(fā)現(xiàn)紫杉醇,為紫杉醇的供給開辟了新的途徑,但紫杉醇在真菌中產(chǎn)量太低(25~50ng/L),需要改良菌種大幅度提高產(chǎn)量才有商業(yè)化的可能。相比之下,利用植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行紫杉醇及紫杉烷的生產(chǎn)具有無可比擬的優(yōu)勢:(1)不占用耕地,生長周期短,不受地區(qū)、季節(jié)和氣候的限制,便于開展大規(guī)模的生產(chǎn);(2)無污染,無重金屬積累,產(chǎn)物疏松,利于有效成分的生產(chǎn)和積累;(3)細(xì)胞生長過程可控制,代謝過程可調(diào)節(jié),有利于提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量,并且避免了利用天然植株產(chǎn)生的無用部位的浪費(fèi);(4)利用高產(chǎn)細(xì)胞株的篩選和復(fù)壯技術(shù),可以使目的產(chǎn)物產(chǎn)率幾倍甚至幾十倍地提高;(5)對培養(yǎng)物誘導(dǎo)或因其自發(fā)突變,可以產(chǎn)生一些原植株所沒有的次生代謝物質(zhì);(6)可用生物轉(zhuǎn)化的方法將一些較初級的化合物轉(zhuǎn)化成醫(yī)藥上更為有效、高值的藥物。采用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇具有很大潛力。PhytonInc和ESCAGenetics公司報道,紫杉細(xì)胞培養(yǎng)到第40天時紫杉醇含量達(dá)0.3mg/g干重。在1998年百時美施貴寶公司與PhytonInc公司簽署協(xié)議采用發(fā)酵技術(shù)使紫杉細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)業(yè)化。2004年,利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇獲得美國總統(tǒng)“綠色化學(xué)獎”。研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)不同誘導(dǎo)方式獲得的細(xì)胞株其表達(dá)的目標(biāo)產(chǎn)物存在顯著差異。紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)過程經(jīng)常會產(chǎn)生紫杉烷類化合物,如,中國紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)體系中發(fā)現(xiàn)含量較高的Tc。自從在中國紅豆杉懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中發(fā)現(xiàn)含量較高的Tc以來,鐘建江教授及其同事使用各種調(diào)控技術(shù)提高Tc的產(chǎn)量,使Tc產(chǎn)量在1L氣升式反應(yīng)器中達(dá)到612mg/L。后來他與合作者使用新合成的誘導(dǎo)子,使得搖瓶中Tc的最高產(chǎn)量在培養(yǎng)第21天達(dá)到856mg/L,反應(yīng)器中Tc的最高產(chǎn)量在培養(yǎng)第21天也達(dá)779mg/L。Choi等在中國紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)第35天獲得Tc的最高產(chǎn)量為885.9mg/L。3愈傷組織的誘導(dǎo)利用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物,首先要篩選含有目標(biāo)次生代謝物的植物及最好的基因型,選擇合適的部位做外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。愈傷誘導(dǎo)過程中篩選合適的生長培養(yǎng)基,進(jìn)行傳代培養(yǎng),經(jīng)過多代培養(yǎng),得到穩(wěn)定生產(chǎn)的細(xì)胞系。從多個細(xì)胞系中篩選生長和生產(chǎn)狀況最好的穩(wěn)定的細(xì)胞系,對之進(jìn)行生物合成途徑、誘導(dǎo)、固定化及基因修飾等方面的研究,最終在反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)大生產(chǎn),進(jìn)行過程工程調(diào)控。4增加細(xì)胞生物量提高細(xì)胞中紫杉醇及紫杉烷的產(chǎn)量包括2個方面:一要提高細(xì)胞的生物量,二要增加目的產(chǎn)物的表達(dá)。要有效提高紫杉醇及紫杉烷的產(chǎn)量,需要綜合考慮以下多方面的因素,有時需將多種方案綜合使用才能達(dá)到理想的效果。4.1組織合成紫杉醇及紫杉烷的能力不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織的能力和誘導(dǎo)的愈傷組織合成紫杉醇及紫杉烷的能力均不同。選擇外植體時應(yīng)考慮到外植體部位、取材季節(jié)、器官生理狀態(tài)和發(fā)育年齡以及外植體的大小等。4.2篩選高產(chǎn)細(xì)胞株解決植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物產(chǎn)量低的有效的手段之一是篩選高產(chǎn)細(xì)胞株。常用的方法有目視法、放射免疫法(RIA)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、流式細(xì)胞測定法和生物法等。4.3養(yǎng)基組成及培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)條件包括培養(yǎng)基組成和pH、溫度、光照、通氣、接種量等的優(yōu)化,其中培養(yǎng)基組成又包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇以及激素的種類和濃度配比等。在紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)過程中向培養(yǎng)基中流加蔗糖溶液,既可以避免前期蔗糖濃度過高的不利影響,又可以在培養(yǎng)后期提供充足的碳源,調(diào)節(jié)滲透壓,利于細(xì)胞的生長和紫杉醇(烷)的生產(chǎn)。4.4固定化培養(yǎng)過程4.4.1固定化細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞有細(xì)胞壁和大的液泡,對剪切力十分敏感,易受機(jī)械損傷。固定化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是在可控條件下使植物懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞聚集成團(tuán)并且限制在特定空間和表面上,使這些細(xì)胞團(tuán)在不損失生物量的同時能連續(xù)不斷地分泌次生代謝物質(zhì)。固定化的方法主要有吸附在載體上,包埋在多孔凝膠珠或微膠囊中。目前這一技術(shù)應(yīng)用中遇到的難題是次生代謝產(chǎn)物釋放的問題,因?yàn)榇蟛糠执紊x產(chǎn)物都儲存在液泡內(nèi),對其自身的積累起著負(fù)反饋?zhàn)饔?使固定化培養(yǎng)不能連續(xù)操作。另外,長時間的固定化培養(yǎng)也易使細(xì)胞受污染。4.4.2兩段培養(yǎng)法生長與生產(chǎn)非偶聯(lián)型的培養(yǎng)體系,細(xì)胞的最適生長條件和最適生產(chǎn)條件是不同的。兩段培養(yǎng)法就是根據(jù)這點(diǎn),把培養(yǎng)過程分為細(xì)胞生長期和次生代謝物生產(chǎn)期2個階段。在不同階段分別采取不同的培養(yǎng)條件,在細(xì)胞生長期使接種細(xì)胞大量繁殖,提高比生長速率,盡快獲得高密度細(xì)胞;在生產(chǎn)期則可保持細(xì)胞的高密度,維持存活率,降低細(xì)胞死亡速率,持續(xù)獲得目標(biāo)產(chǎn)物。4.4.3兩相培養(yǎng)法植物細(xì)胞兩相培養(yǎng)是在細(xì)胞外創(chuàng)造一個儲藏次生代謝產(chǎn)物的單元(如固體吸附劑),從而打破原有產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)、外水相的平衡,使目的產(chǎn)物產(chǎn)量大幅度提高。采用兩相培養(yǎng)技術(shù)可以減少次生代謝產(chǎn)物的反饋抑制作用,保護(hù)次生代謝產(chǎn)物免受酶的分解,簡化下游處理過程,除去培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)。固液兩相培養(yǎng)中使用的固體吸附劑有:AmberlteXAD-2,XAD-4,XAD-7,XAD-8,XAD-16等?？捎糜谏a(chǎn)各種次生代謝產(chǎn)物,包括紫杉醇。固體吸附劑的加入方式有以下3種:(1)直接添加到培養(yǎng)體系中;(2)包裹后加入到培養(yǎng)體系中;(3)不添加到培養(yǎng)體系中,而是加到柱子中進(jìn)行培養(yǎng)基的循環(huán),吸附培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物。固體吸附劑通常是在培養(yǎng)細(xì)胞的指數(shù)生長初期加入,與其他調(diào)控手段聯(lián)合使用提高培養(yǎng)細(xì)胞次生代謝物的產(chǎn)量。4.5紫杉醇合成前體物物價值的合成前體指處于目標(biāo)代謝物代謝途徑中上游的物質(zhì),加入前體可以消除關(guān)鍵酶的阻礙或阻斷內(nèi)源性中間體的分隔和有效貯存,利于次生代謝物的生產(chǎn)。草酸鈉是紫杉醇C-10位乙?；那绑w物,加入后雖然可提高紫杉醇產(chǎn)量,但幅度有限;檸檬酸是紫杉醇三環(huán)二萜合成的前體物,加入后對紫杉醇合成的影響相對明顯;α-苯丙氨酸和β-苯丙氨酸均是紫杉醇C-13側(cè)鏈的前體物,若添加濃度合適,會對紫杉醇合成產(chǎn)生較大影響。研究發(fā)現(xiàn),單種前體的加入對紫杉醇產(chǎn)量的影響不大,不同前體配伍可明顯提高紫杉醇產(chǎn)量。4.6紫杉醇的誘導(dǎo)誘導(dǎo)子指能與細(xì)胞發(fā)生相互作用,通過胞內(nèi)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,作用于細(xì)胞次生代謝相關(guān)的基因表達(dá),進(jìn)而改變細(xì)胞次生代謝相關(guān)酶的活力,最終使細(xì)胞次生代謝水平發(fā)生改變的物質(zhì)。誘導(dǎo)子對植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的影響與誘導(dǎo)子的濃度、誘導(dǎo)子作用的時間等因素有關(guān)。不同誘導(dǎo)子的加入可導(dǎo)致紫杉烷類不同譜分布,即具有不同的誘導(dǎo)選擇性。4.6.1水楊酸水楊酸(salicylicacid,SA)作為一種新的植物激素,在植物抗病反應(yīng)中發(fā)揮了重要的信號分子作用。紫杉醇作為紅豆杉屬植物產(chǎn)生的一種植保素,它的產(chǎn)生與細(xì)胞的抗性反應(yīng)有著緊密的聯(lián)系。因此SA也可誘導(dǎo)紫杉醇的產(chǎn)生,這方面有一些報道,但新的深入研究仍較少。4.6.2硝酸銀韓國Samyang公司研究者發(fā)現(xiàn)濃度為10μmol/L硝酸銀加入培養(yǎng)基1周后,紫杉醇產(chǎn)量開始明顯上升,最高產(chǎn)量達(dá)98.95mg/L,為對照組的4.7倍。茉莉酮酸類誘導(dǎo)子在紫杉醇誘導(dǎo)中應(yīng)用普遍。甲基茉莉酮酸在誘導(dǎo)紫杉醇產(chǎn)量提高的同時,巴卡亭III、10-DAB產(chǎn)量下降,三尖杉寧堿在對照組和誘導(dǎo)組產(chǎn)量均非常低,沒有明顯變化。4.6.4花生四烯酸Srinivasan發(fā)現(xiàn)花生四烯酸誘導(dǎo)下中國紅豆杉愈傷組織中紫杉醇產(chǎn)量提高了9.3倍。花生四烯酸濃度為0.1mg/L時,紫杉醇產(chǎn)量最高。4.6.5檸檬酸銨Samyang公司的研究人員發(fā)現(xiàn)檸檬酸銨對紫杉醇產(chǎn)量的促進(jìn)作用比硝酸銀更快,其對紫杉醇生產(chǎn)的促進(jìn)作用在添加1周內(nèi)即體現(xiàn)出來,在加入1~2周時間內(nèi),對紫杉醇生產(chǎn)的促進(jìn)作用達(dá)最大,紫杉醇最高產(chǎn)量達(dá)103.6mg/L,約為對照組的5倍。4.6.6稀土元素對紅豆杉細(xì)胞紫杉醇生產(chǎn)的影響硝酸鈰銨、硝酸鑭、硝酸亞鈰均能明顯提高紅豆杉細(xì)胞合成紫杉醇的能力,其中硝酸鈰銨能力最強(qiáng),可使細(xì)胞中紫杉醇產(chǎn)量提高12倍,發(fā)酵液中紫杉醇產(chǎn)量提高5倍。4.7優(yōu)化代謝途徑抑制劑可抑制支路代謝和其他相關(guān)次生代謝途徑,使代謝過程有利于目的次生代謝物的產(chǎn)生。矮壯素被認(rèn)為是旁路代謝抑制劑,使代謝向生成紫杉醇的方向進(jìn)行。5問題和建議5.1紫杉醇及紫杉烷產(chǎn)量調(diào)控的過程(1)許多建立起來的紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系不生產(chǎn)紫杉醇,只生產(chǎn)另一代謝支路的14位氧化的紫杉烷。(2)提高紫杉醇及紫杉烷產(chǎn)量的調(diào)控策略大多集中于生物合成過程,較少留意后生物合成過程——紫杉醇及紫杉烷合成后的運(yùn)輸、貯藏、分泌、降解等過程。事實(shí)上,紫杉醇及紫杉烷最終的產(chǎn)量高低不僅取決于生物合成能力,也取決于生物合成后的貯運(yùn)分解情況。5.2生物合成產(chǎn)物的修飾及貯藏(1)在酶和分子水平闡明紫杉醇及紫杉烷的生物合成途