一種提取肝組織中單胺氧化酶的方法

一種提取肝組織中單胺氧化酶的方法

人體衰退是一個漸進而復雜的過程。衰老是人體生理與病理過程相互作用的結(jié)果。生理環(huán)開始衰老，病理環(huán)加速衰老。衰老不是疾病,與疾病有不同的發(fā)生機理,但與疾病有著共生和相互促進的關(guān)系,多數(shù)情況下很難區(qū)分因病而衰還是因衰而病。美國哈佛醫(yī)學院Wu在《人體革命》中稱,按人體生長規(guī)律和基因特點推測,人類潛在壽命可達150歲,然而由于老年疾病的影響,恐怕無人能活到其自然壽限。在衰老過程中,各種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)對記憶形成和維持起著很重要的作用。機體內(nèi)單胺氧化酶(monoamineoxidase,MAO,EC1.4.3.4)的主要功能就是催化內(nèi)源性和外源性單胺類物質(zhì)的代謝,具有重要的生理功能。人體中MAO的活性異常會使細胞內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運出現(xiàn)紊亂,產(chǎn)生諸多衰老疾病如老年癡呆癥、帕金森綜合征等。隨著MAO活性的不斷升高,不僅會導致腦生理功能的退化,而且還會引起整個機體逐步衰老。因此MAO被認為是老化的標志,故又稱之為老化相關(guān)酶。本研究從老齡雄性大鼠肝臟中提取出單胺氧化酶,并進行了相關(guān)的定性定量檢測,以該酶作為靶位酶所建立的抗衰老生物學體外模型可應用到功能性物質(zhì),如益生菌的篩選過程中。1材料和方法1.1犬尿胺、clor未定形Wistar雄性老年大鼠(上海斯萊克實驗動物責任公司);犬尿胺、Clorgyline、Selegiline(Sigma公司);牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G250、蔗糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(國藥上?；瘜W試劑公司)。1.2高速冷凍離心系統(tǒng)ij30i、cat5SPECORD205型紫外分光光度計(德國耶拿公司);AVANTIJ30I型高速冷凍離心機(美國BECKMAN公司);KAT25型高速組織分散器(德國IKA公司);XW-80A型漩渦混合儀(上海青浦滬西儀器廠);DK-8D型電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設備公司)。1.3測試方法1.3.1肝臟組織mao的提取參考Hu等和Stafford等的方法并加以改進,從大鼠的肝組織勻漿中分離得到初級純化的MAO。Wistar雄性老年大鼠通過斷髓致死,無菌操作取出肝臟,在預冷的磷酸鉀緩沖液(0.2mol/L,pH值7.6)中洗滌后,貯存于-85℃待用。肝組織(5g)以1g∶40mL的比例在0.3mol/L蔗糖溶液中勻漿,采用低溫差速離心法分離線粒體:將勻漿置于低溫高速離心機1000g離心10min,棄沉淀,上清液經(jīng)10000g離心30min,沉淀即為提取的肝臟粗線粒體,整個過程溫度控制在0～4℃。將沉淀重懸于4mL0.3mol/L的蔗糖溶液中,充分混勻,上樣于40mL,1.2mol/L的蔗糖溶液中,53000g離心40min即可得到純度較高的肝臟線粒體,其中MAO定位在線粒體外膜上且結(jié)合緊密。用磷酸鉀緩沖液將線粒體洗滌1次后,懸浮在40mL的該緩沖液中,即為MAO粗提物,分裝成每管1mL,-85℃儲存?zhèn)溆谩?.3.2mao抑制劑的確定以陽性對照組(粗提物+底物),陰性對照組(pH值7.6緩沖液+底物),clorgyline組(粗提物+底物+clorgyline)和selegiline組(粗提物+底物+selegiline)對從老齡大鼠肝臟中提取得到的MAO進行確證,其中clorgyline和selegiline分別是MAO-A和MAO-B的專一性抑制劑,反應濃度均為10μg/mL。上述4組中粗提物均取50μL(陰性對照組以50μL緩沖液代替粗提物),加入1mmol/L的底物犬尿胺100μL及磷酸鉀緩沖液(0.2mol/L,pH值7.6)750μL。在360nm處測定初始吸光值,隨后于37℃水浴保溫1h,測定終點吸光值。以底物消耗作為酶活測定指標:酶活定義為37℃,pH值7.6條件下,1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1nmol底物的酶量為1個酶單位(U)。1.3.3牛血清白蛋白的檢測為了試驗中MAO的定量,有必要測定其蛋白量。采用考馬斯亮藍G250的方法?？捡R斯亮藍G250的磷酸溶液呈棕紅色,當與牛血清白蛋白結(jié)合時形成的復合物呈藍色,最大吸收峰波長為595nm?？捡R斯亮藍G250-蛋白復合物的高消光效應導致了蛋白質(zhì)定量測定的高敏感度。在一定范圍內(nèi),考馬斯亮藍G250-蛋白質(zhì)復合物呈色后,在595nm處,測定的吸光值與蛋白含量呈線性關(guān)系。2結(jié)果2.1鼠肝臟勻漿粗提物中mao成分的鑒定國內(nèi)MAO的提取流程普遍采用肝臟勻漿直接作為酶的來源,未對其中的MAO進一步純化。本試驗則對來源于肝臟的MAO進行了初級純化,利用低溫差速離心法獲得的MAO純度更高,有利于后續(xù)試驗操作。老齡大鼠肝臟勻漿粗提物中MAO成分的確證詳見表1。從表1發(fā)現(xiàn),陽性對照組在含有粗提物的條件下,360nm處底物犬尿胺的吸光度明顯下降,所對應的陰性組底物吸光度幾乎沒有變化,說明在粗提物中含有能促進犬尿胺消耗的活性物質(zhì);通過Clorgyline組和Selegiline組發(fā)現(xiàn),當反應體系中加入了這2種化學合成藥物后,底物吸光度下降程度明顯減弱,說明clorgyline和selegiline對體系中催化犬尿胺消耗的活性物質(zhì)具有顯著的抑制作用,而clorgyline和selegiline分別屬于MAO-A和MAO-B的專一性抑制劑,這就證明了在經(jīng)過初步純化的分離物中確實存在有MAO。2.2蛋白質(zhì)含量測定試驗中以牛血清白蛋白作為標準蛋白,以不同反應濃度(200、400、600、800、1000μg/mL)與考馬斯亮藍G250進行絡合反應,測定在不同濃度下反應體系的595nm處吸光值,通過線性回歸得到標準曲線。圖1為蛋白質(zhì)含量標準曲線,其線性相關(guān)性為0.9951,待測樣品在595nm處所測得的吸光值為0.2879,通過方程計算出相應酶蛋白量為869.15μg/mL。根據(jù)酶活定義,并參考底物轉(zhuǎn)化量及測定的蛋白含量,計算出肝臟粗提單胺氧化酶的絕對酶活為30.7U/mg。3mao活性測定單胺氧化酶活性異常所導致的諸多老年疾病以男性患者居多,因此本試驗選取雄性老年大鼠肝臟作為單胺氧化酶的提取來源。試驗中采用低溫差速離心法獲得了單胺氧化酶的粗酶液,并對單胺氧化酶進行了活性測定。通過陽性/陰性對照試驗及MAO-A/B抑制劑反應試驗證實