一種提取肝組織中單胺氧化酶的方法

一種提取肝組織中單胺氧化酶的方法

人體衰退是一個(gè)漸進(jìn)而復(fù)雜的過程。衰老是人體生理與病理過程相互作用的結(jié)果。生理環(huán)開始衰老，病理環(huán)加速衰老。衰老不是疾病,與疾病有不同的發(fā)生機(jī)理,但與疾病有著共生和相互促進(jìn)的關(guān)系,多數(shù)情況下很難區(qū)分因病而衰還是因衰而病。美國哈佛醫(yī)學(xué)院Wu在《人體革命》中稱,按人體生長規(guī)律和基因特點(diǎn)推測,人類潛在壽命可達(dá)150歲,然而由于老年疾病的影響,恐怕無人能活到其自然壽限。在衰老過程中,各種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)對記憶形成和維持起著很重要的作用。機(jī)體內(nèi)單胺氧化酶(monoamineoxidase,MAO,EC1.4.3.4)的主要功能就是催化內(nèi)源性和外源性單胺類物質(zhì)的代謝,具有重要的生理功能。人體中MAO的活性異常會(huì)使細(xì)胞內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)出現(xiàn)紊亂,產(chǎn)生諸多衰老疾病如老年癡呆癥、帕金森綜合征等。隨著MAO活性的不斷升高,不僅會(huì)導(dǎo)致腦生理功能的退化,而且還會(huì)引起整個(gè)機(jī)體逐步衰老。因此MAO被認(rèn)為是老化的標(biāo)志,故又稱之為老化相關(guān)酶。本研究從老齡雄性大鼠肝臟中提取出單胺氧化酶,并進(jìn)行了相關(guān)的定性定量檢測,以該酶作為靶位酶所建立的抗衰老生物學(xué)體外模型可應(yīng)用到功能性物質(zhì),如益生菌的篩選過程中。1材料和方法1.1犬尿胺、clor未定形Wistar雄性老年大鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任公司);犬尿胺、Clorgyline、Selegiline(Sigma公司);牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G250、蔗糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(國藥上?；瘜W(xué)試劑公司)。1.2高速冷凍離心系統(tǒng)ij30i、cat5SPECORD205型紫外分光光度計(jì)(德國耶拿公司);AVANTIJ30I型高速冷凍離心機(jī)(美國BECKMAN公司);KAT25型高速組織分散器(德國IKA公司);XW-80A型漩渦混合儀(上海青浦滬西儀器廠);DK-8D型電熱恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司)。1.3測試方法1.3.1肝臟組織mao的提取參考Hu等和Stafford等的方法并加以改進(jìn),從大鼠的肝組織勻漿中分離得到初級純化的MAO。Wistar雄性老年大鼠通過斷髓致死,無菌操作取出肝臟,在預(yù)冷的磷酸鉀緩沖液(0.2mol/L,pH值7.6)中洗滌后,貯存于-85℃待用。肝組織(5g)以1g∶40mL的比例在0.3mol/L蔗糖溶液中勻漿,采用低溫差速離心法分離線粒體:將勻漿置于低溫高速離心機(jī)1000g離心10min,棄沉淀,上清液經(jīng)10000g離心30min,沉淀即為提取的肝臟粗線粒體,整個(gè)過程溫度控制在0～4℃。將沉淀重懸于4mL0.3mol/L的蔗糖溶液中,充分混勻,上樣于40mL,1.2mol/L的蔗糖溶液中,53000g離心40min即可得到純度較高的肝臟線粒體,其中MAO定位在線粒體外膜上且結(jié)合緊密。用磷酸鉀緩沖液將線粒體洗滌1次后,懸浮在40mL的該緩沖液中,即為MAO粗提物,分裝成每管1mL,-85℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.3.2mao抑制劑的確定以陽性對照組(粗提物+底物),陰性對照組(pH值7.6緩沖液+底物),clorgyline組(粗提物+底物+clorgyline)和selegiline組(粗提物+底物+selegiline)對從老齡大鼠肝臟中提取得到的MAO進(jìn)行確證,其中clorgyline和selegiline分別是MAO-A和MAO-B的專一性抑制劑,反應(yīng)濃度均為10μg/mL。上述4組中粗提物均取50μL(陰性對照組以50μL緩沖液代替粗提物),加入1mmol/L的底物犬尿胺100μL及磷酸鉀緩沖液(0.2mol/L,pH值7.6)750μL。在360nm處測定初始吸光值,隨后于37℃水浴保溫1h,測定終點(diǎn)吸光值。以底物消耗作為酶活測定指標(biāo):酶活定義為37℃,pH值7.6條件下,1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1nmol底物的酶量為1個(gè)酶單位(U)。1.3.3牛血清白蛋白的檢測為了試驗(yàn)中MAO的定量,有必要測定其蛋白量。采用考馬斯亮藍(lán)G250的方法。考馬斯亮藍(lán)G250的磷酸溶液呈棕紅色,當(dāng)與牛血清白蛋白結(jié)合時(shí)形成的復(fù)合物呈藍(lán)色,最大吸收峰波長為595nm?？捡R斯亮藍(lán)G250-蛋白復(fù)合物的高消光效應(yīng)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)定量測定的高敏感度。在一定范圍內(nèi),考馬斯亮藍(lán)G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物呈色后,在595nm處,測定的吸光值與蛋白含量呈線性關(guān)系。2結(jié)果2.1鼠肝臟勻漿粗提物中mao成分的鑒定國內(nèi)MAO的提取流程普遍采用肝臟勻漿直接作為酶的來源,未對其中的MAO進(jìn)一步純化。本試驗(yàn)則對來源于肝臟的MAO進(jìn)行了初級純化,利用低溫差速離心法獲得的MAO純度更高,有利于后續(xù)試驗(yàn)操作。老齡大鼠肝臟勻漿粗提物中MAO成分的確證詳見表1。從表1發(fā)現(xiàn),陽性對照組在含有粗提物的條件下,360nm處底物犬尿胺的吸光度明顯下降,所對應(yīng)的陰性組底物吸光度幾乎沒有變化,說明在粗提物中含有能促進(jìn)犬尿胺消耗的活性物質(zhì);通過Clorgyline組和Selegiline組發(fā)現(xiàn),當(dāng)反應(yīng)體系中加入了這2種化學(xué)合成藥物后,底物吸光度下降程度明顯減弱,說明clorgyline和selegiline對體系中催化犬尿胺消耗的活性物質(zhì)具有顯著的抑制作用,而clorgyline和selegiline分別屬于MAO-A和MAO-B的專一性抑制劑,這就證明了在經(jīng)過初步純化的分離物中確實(shí)存在有MAO。2.2蛋白質(zhì)含量測定試驗(yàn)中以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,以不同反應(yīng)濃度(200、400、600、800、1000μg/mL)與考馬斯亮藍(lán)G250進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng),測定在不同濃度下反應(yīng)體系的595nm處吸光值,通過線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖1為蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線,其線性相關(guān)性為0.9951,待測樣品在595nm處所測得的吸光值為0.2879,通過方程計(jì)算出相應(yīng)酶蛋白量為869.15μg/mL。根據(jù)酶活定義,并參考底物轉(zhuǎn)化量及測定的蛋白含量,計(jì)算出肝臟粗提單胺氧化酶的絕對酶活為30.7U/mg。3mao活性測定單胺氧化酶活性異常所導(dǎo)致的諸多老年疾病以男性患者居多,因此本試驗(yàn)選取雄性老年大鼠肝臟作為單胺氧化酶的提取來源。試驗(yàn)中采用低溫差速離心法獲得了單胺氧化酶的粗酶液,并對單胺氧化酶進(jìn)行了活性測定。通過陽性/陰性對照試驗(yàn)及MAO-A/B抑制劑反應(yīng)試驗(yàn)證實(shí)