可視化研究未來運(yùn)動模型中星蟲肽的抗氧化能力

可視化研究未來運(yùn)動模型中星蟲肽的抗氧化能力

可口可豆星蟲屬于星興動物門的甲殼類星蟲綱，主要分布在浙江和福建沿海海灘。多種本草中記載了星蟲具有廣泛的藥物功效。近年來,星蟲養(yǎng)殖技術(shù)的逐漸成熟,為進(jìn)一步開發(fā)星蟲的食用和藥用價(jià)值打開了資源制約的瓶頸,但目前尚未見有關(guān)星蟲肽的制備及其藥物功效的研究報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)可口革囊星蟲蛋白質(zhì)含量很高,占干重的65%。本研究前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)星蟲肽在體外具有顯著的抗氧化效果,為進(jìn)一步驗(yàn)證星蟲肽在體內(nèi)的作用,采用SD大鼠游泳訓(xùn)練模型,探討星蟲肽在運(yùn)動中的抗氧化功效,旨在為開發(fā)利用星蟲肽運(yùn)動保健品提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1試劑和試劑盒可口革囊星蟲由浙江省溫嶺市水產(chǎn)漁業(yè)推廣站提供,所有樣品-20℃保存待用;Protamexue617蛋白質(zhì)水解酶購自Novozymes公司(活力單位為:1.5AU/g);超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、一氧化氮合酶(NOS)、肌糖原試劑盒購自南京建成生物研究所;Lipidhydroperoxide(LPO)試劑盒購自美國Cayman公司;丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tricine、TEMED、dithiothreitol、過硫酸銨、脲、甘氨酸、天冬酰氨、絲氨酸均購自上海生工;其他試劑為國產(chǎn)分析純。1.1.2紫外可見分光光度計(jì)MultiskanMK3酶標(biāo)儀(ThermoLabsystems公司);冷凍干燥機(jī)(美國LABCON公司);UV-7504紫外可見分光光度計(jì)(上海欣茂儀器有限公司);S-212恒速攪拌器(上海申順生物科技有限公司);R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申順生物科技有限公司);W201恒溫水浴鍋(上海申順生物科技有限公司);0-A型數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱(瀘奧科學(xué)儀器廠);FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)(上海標(biāo)本模型廠);BC-2000血液細(xì)胞分析儀;Bio-Rad電泳儀;BG-verMINI迷你垂直電泳儀。1.2星蟲多孔的制備和分析1.2.1星蟲蛋白的提取先將樣品洗凈粉碎后,加入約6倍體積的水,同時(shí)加入0.3%NaCl(W/V),放置在超聲波中15min,放置在電爐上煮40min后過濾,加入等量蒸餾水與NaCl,水煮30min后再過濾,合并兩次濾液,3000r/m離心20min,取上清液置于4℃冰箱保存待用。采用微量凱氏定氮法測定樣品中提取的蛋白質(zhì)的濃度。將星蟲蛋白在50℃水浴中按酶與底物濃度比為0.4AU/g水解制備星蟲肽,水解度控制在10.2%,水解結(jié)束水浴鍋溫度迅速升至90℃,保持15min使酶滅活,過濾(濾去被滅活的蛋白質(zhì)水解酶);制備樣品濃縮后,采用陽離子交換樹脂一步洗脫法,分別純化星蟲蛋白與水解肽,濃縮與冷凍干燥后置于-20℃冰箱保存待用。1.2.2tis-固相膠質(zhì)凝膠電泳根據(jù)Sung-KunYim等方法,對制備的星蟲蛋白質(zhì)與多肽進(jìn)行電泳分析,具體方法為:分離膠配制:17%的丙烯酰氨/雙丙烯酰氨,120mmol/LTris–HCl,50mmol/Ltricine,0.5%(W/V)甘油和3種氨基酸(天冬酰氨、甘氨酸、絲氨酸,各0.1mmol/L),pH=7.4。樣品緩沖液配制:60mmol/LTris–HCl,pH=6.8,2%(W/V)SDS,10%(W/V)甘油,0.1mol/Ldithiothreitol,0.01%(W/V)溴酚藍(lán)。緩沖液配制:25mmol/LTris,192mmol/L甘氨酸,0.1%(W/V)SDS。樣品準(zhǔn)備:將配制好的樣品,加入脲(最終濃度為3mol/L)。聚丙烯酰胺凝膠制備方法:將配制好分離膠溶液,加入8μlTEMED后,輕輕搖勻,用移液槍將該溶液灌入82mm×97mm、厚1mm的凝膠板中,插入梳子后固定30min。上樣樣品準(zhǔn)備:20μl樣品加入5μl上樣緩沖液,上樣前95℃水浴4min。上樣與電泳:每孔上樣15μl,電泳儀使用恒定電壓,90V。電泳結(jié)束后,聚丙烯胺凝膠用0.1%的考馬斯亮藍(lán)(0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250、45%甲醇、10%乙酸)染色1h,之后用脫色液(5%甲醇、7%乙酸)脫色24h。1.3動物實(shí)驗(yàn)1.3.1星蟲水解肽運(yùn)動劑量n,n50只3周齡雄性SD大鼠(實(shí)驗(yàn)動物號為SCXK(浙)2003-0001)隨機(jī)分成8組,分別為:(1)生理鹽水安靜組(A組,n=6);(2)星蟲蛋白安靜組(B組,n=6);(3)低劑量星蟲水解肽安靜組(C組,n=6);(4)高劑量星蟲水解肽安靜組(D組,n=6);(5)生理鹽水運(yùn)動組(E組,n=6);(6)星蟲蛋白運(yùn)動組(F組,n=6);(7)低劑量星蟲水解肽運(yùn)動組(G組,n=7);(8)高劑量星蟲水解肽運(yùn)動組(G組,n=7)。采用灌胃方式補(bǔ)充,生理鹽水組灌服等量的生理鹽水,星蟲蛋白質(zhì)組、低劑量星蟲水解肽組、高劑量星蟲水解肽組的灌服劑量分別為0.26g/kg、0.09g/kg、0.26g/kg。實(shí)驗(yàn)前與實(shí)驗(yàn)結(jié)束前測定大鼠體重的變化。1.3.2飼養(yǎng)對空間的制備將大鼠飼養(yǎng)在寧波大學(xué)普通級動物房中,鼠飼料購自浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心。在動物移入前,先用甲醛熏蒸12小時(shí),通風(fēng)3~4天后,用甲酚皂溶液擦洗房間角落,做到徹底滅菌;飼養(yǎng)房間溫度控制為22±2℃,24小時(shí)通風(fēng)系統(tǒng)運(yùn)作;操作人員穿無菌衣,帶口罩、鞋套、手套進(jìn)出動物房。游泳裝置為3個(gè)80cm×90cm×80cm長方形塑料容器。游泳水溫控制在30℃±1℃,游泳結(jié)束后將每只大鼠用干毛巾擦干。1.3.3生物樣品采集參考Pimenta等建立的運(yùn)動模型,具體步驟為:適應(yīng)性訓(xùn)練2天,每天游泳1次,每次15min,以后每天遞增游泳時(shí)間15min,到訓(xùn)練第5天增至1h,以后每天維持這個(gè)負(fù)荷至第15天。第16天訓(xùn)練時(shí)間增至2.5h,游泳結(jié)束后1h將大鼠處死(所有運(yùn)動組大鼠在給藥后30min開始訓(xùn)練)。各安靜組在第16天給藥后1h處死。生物樣品采集流程為乙醚麻醉、頸動脈取血、取肝組織、取腓腸肌。采用BC-2000血液細(xì)胞分析儀測定血液常規(guī)指標(biāo)(加肝素抗凝),其它生化指標(biāo)測定嚴(yán)格按照試劑盒說明操作方法與步驟進(jìn)行(血液指標(biāo)在12h內(nèi)測定)。1.3.4統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析,統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,顯著性差異水平為P<0.05。2結(jié)果2.1星蟲蛋白質(zhì)電泳分析通過提取星蟲蛋白質(zhì),獲得的蛋白質(zhì)水溶液占總蛋白質(zhì)含量的42%,用離子交換樹脂層析初步分離后,純度為95%左右。采用蛋白酶對提取的蛋白質(zhì)水解10h,然后經(jīng)過陽離子交換樹脂純化步驟得到星蟲多肽。將獲得的星蟲蛋白質(zhì)與水解多肽進(jìn)行電泳分析,結(jié)果如圖1:左邊的電泳圖譜條帶為蛋白質(zhì)MARKER;中間的是星蟲蛋白質(zhì)電泳圖譜條帶,表明星蟲蛋白質(zhì)分子量主要由66kd以上、27kd、9.5kd和4.1~6.5kd四部分組成;右邊的是水解多肽圖譜條帶,表明水解后的星蟲肽的分子量小于4.1kd,根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推測平均含10個(gè)氨基酸殘基。2.2動物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果2.2.1對各運(yùn)動組體重的影響表1顯示,2周實(shí)驗(yàn)后各組大鼠體重較實(shí)驗(yàn)前顯著增加(P<0.01),各運(yùn)動組體重均低于安靜組,但除第3組與第5和7組有顯著性差異(P<0.05)外,其它各組均無顯著性差異(P>0.05)。2.2.2星蟲肽對海蘇血藥濃度的影響RBC結(jié)果:2周實(shí)驗(yàn)后,安靜組(1~4組)中的高、低劑量星蟲肽組RBC水平較生理鹽水組和星蟲蛋白組略高,但無顯著性差異(P>0.05);運(yùn)動組(5~8組)中的低劑量星蟲肽運(yùn)動組RBC明顯高于生理鹽水運(yùn)動組和星蟲蛋白運(yùn)動組(P<0.05),高劑量星蟲肽組也高于生理鹽水運(yùn)動組和星蟲蛋白運(yùn)動組,但無顯著性差異(P>0.05);安靜組與運(yùn)動組之間(1~8組)比較,高、低劑量星蟲肽運(yùn)動組RBC水平分別略高于高、低劑量星蟲肽安靜組,但無顯著性差異(P>0.05)。Hb結(jié)果:安靜組(1~4組)中的低劑量星蟲肽組Hb高于生理鹽水組和星蟲蛋白組,但只與生理鹽水組有顯著性差異(P<0.05);運(yùn)動組(5~8組)中的低劑量星蟲肽組Hb高于生理鹽水組、星蟲蛋白組和高劑量星蟲肽組(P<0.05);安靜組與運(yùn)動組之間(1~8組)比較,低劑量星蟲肽運(yùn)動組Hb高于高劑量星蟲肽安靜組(P<0.05),略高于低劑量星蟲肽安靜組,但無顯著性差異(P>0.05)。HCT結(jié)果:安靜組(1~4組)中和高、低星蟲肽組HCT略高于生理鹽水組和星蟲蛋白組,但無顯著性差異;運(yùn)動組(5~8組)中的低劑量星蟲肽組HCT均顯著高于生理鹽水運(yùn)動組和蛋白質(zhì)組(P<0.05),但高、低劑量組之間無顯著性差異(P>0.05);運(yùn)動組與安靜組之間(1~8)比較,低劑量星蟲肽運(yùn)動組HCT顯著高于低劑量星蟲肽安靜組(P<0.05),高劑量星蟲肽運(yùn)動組略高于高劑量星蟲肽安靜組,但無顯著性差異(P>0.05)。2.2.3星蟲肽對gsh-px和nos活性的影響SOD活性結(jié)果:安靜組(1~4組)中的高劑量星蟲肽組血清SOD活性顯著高于生理鹽水組和星蟲蛋白質(zhì)組(P<0.05),但與低劑量星蟲肽組之間比較無顯著性差異(P>0.05);運(yùn)動組(5~8組)中的高劑量星蟲肽組血清SOD活性均顯著高于生理鹽水組、星蟲蛋白組和低劑量星蟲肽組(P<0.05),而低劑量星蟲肽組顯著高于生理鹽水組和星蟲蛋白組(P<0.05);安靜組與運(yùn)動組之間(1~8組)比較,高劑量星蟲肽運(yùn)動組SOD活性顯著高于低劑量星蟲肽安靜組(P<0.05)。GSH-PX活性結(jié)果:安靜組(1~4組)中的高劑量星蟲肽組GSH-PX活性顯著高于星蟲蛋白組和生理鹽水組(P<0.05);運(yùn)動組(5~8組)中的低劑量星蟲肽組顯著高于生理鹽水組,高劑量星蟲肽組顯著高于生理顯著鹽水組和星蟲蛋白組(P<0.05);安靜組與運(yùn)動組之間(1~8組)比較,高、低劑量星蟲肽運(yùn)動組GSH-PX活性均分別高于高、低劑量星蟲肽安靜組,但無顯著性差異(P>0.05)。NOS活性結(jié)果:安靜組(1~4組)中低劑量星蟲肽組NOS活性顯著低于生理鹽水組(P<0.05);運(yùn)動組(5~8組)中低、高劑量星蟲肽組顯著低于生理鹽水組和蛋白組(P<0.05),但高、低劑量星蟲肽組之間無顯著性差異(P>0.05);運(yùn)動組與安靜組之間(1~8組)比較,低劑量星蟲肽安靜組NOS活性顯著低于低劑量星蟲肽運(yùn)動組(P<0.05)。2.2.4星蟲肽運(yùn)動與gsh-px活性SOD活性結(jié)果:安靜組(1~4組)中高、低劑量星蟲肽組肝組織SOD活性高于生理鹽水組和星蟲蛋白組,但無顯著性差異(P>0.05);運(yùn)動組(5~8組)中高、低劑量星蟲肽組SOD活性顯著高于生理鹽水組和星蟲蛋白組(P<0.05),但高、低星蟲肽組之間無顯著性差異(P>0.05);運(yùn)動組與安靜組之間(1~8組)比較,高、低劑量星蟲肽運(yùn)動組SOD活性高于高、低劑量星蟲肽安靜組,但無顯著性差異(P>0.05)。GSH-PX活性結(jié)果:安靜組(1~4組)中高劑量星蟲肽組GSH-PX活性與生理鹽水組比較有顯著性差異(P<0.05);運(yùn)動組(5~8組)中高劑量星蟲肽組肝組織GSH-PX活性均顯著高于生理鹽水組、星蟲蛋白組和低劑量星蟲肽組(P<0.05),低劑量星蟲肽組高于生理鹽水組和星蟲蛋白組,但無顯著性差異(P>0.05);安靜組與運(yùn)動組之間(1~8組)比較,高劑量星蟲肽運(yùn)動組顯著高于高劑量星蟲肽安靜組(P<0.05),低劑量星蟲肽運(yùn)動組高于低劑量星蟲肽安靜組,但無顯著性差異(P>0.05)。LPO結(jié)果:安靜組(1~4組)中高、低劑量星蟲肽組LPO含量低于生理鹽水組與蛋白組,但只有高劑量星蟲肽組與生理鹽水組有顯著性差異(P<0.05);運(yùn)動組(5~8組)中高、低劑量星蟲肽組顯著低于生理鹽水組和星蟲蛋白組(P<0.05)。安靜組與運(yùn)動組之間(1~8組)比較,生理鹽水、星蟲蛋白安靜組LPO含量分別與其對應(yīng)的生理鹽水、星蟲蛋白運(yùn)動組相比有顯著性差異(P<0.05)。2.2.5星蟲蛋白對星蟲蛋白的影響表5顯示,安靜組(1~4組),高、低劑量星蟲肽組大鼠腓腸肌糖原含量高于生理鹽水組和星蟲蛋白組,但無顯著性差異(P>0.05);運(yùn)動組(5~6組)中高低劑量星蟲肽組肌糖原含量低于生理鹽水組和星蟲蛋白組,但無顯著性差異(P>0.05);安靜組與運(yùn)動組(1~8組)之間比較,安靜組肌糖原含量高于運(yùn)動組,但無顯著性差異(P>0.05)。3補(bǔ)充活性肽對sd大鼠肝組織sod、gsh-px活性的影響星蟲蛋白質(zhì)的提取是本研究的基礎(chǔ),在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)提取率與溫度有直接聯(lián)系,隨著溫度的升高提取率也隨之增加。本研究采用傳統(tǒng)的水煮方法作為提取蛋白質(zhì)的手段,蛋白質(zhì)提取率為42%左右,該方法操作方便,提取時(shí)間短、效率高,比較適合本研究。雖水煮會引起部分蛋白質(zhì)變性,但這對本實(shí)驗(yàn)并未產(chǎn)生影響,因水煮方法會使蛋白質(zhì)多肽鏈變得松散,提取的蛋白質(zhì)更有利于酶水解。對星蟲蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物用陽離子交換樹脂初步純化,制備出比較純的星蟲肽。星蟲肽主要借助小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被吸收到體內(nèi)及組織間進(jìn)行運(yùn)輸,至今發(fā)現(xiàn)2種小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PEPT1和PEPT2),其中PEPT1是小腸吸收食物中小肽最主要的蛋白。文獻(xiàn)報(bào)道,將蛋白質(zhì)水解成肽比原蛋白更具有營養(yǎng)價(jià)值。Tassi等研究發(fā)現(xiàn)在運(yùn)動中給老鼠補(bǔ)充α-牛乳白蛋白及與其對應(yīng)的水解肽(水解度,DH~15%),4周運(yùn)動后發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充水解肽的動物血糖、血清白蛋白與肌糖原含量明顯高于補(bǔ)充原蛋白組。多肽比混合氨基酸更易吸收,Boza等對饑餓的老鼠補(bǔ)充多肽及與其相當(dāng)比例的混合氨基酸,發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充多肽的老鼠恢復(fù)明顯快于補(bǔ)充混合氨基酸者。李世成等通過研究活性肽在大鼠小腸的吸收特點(diǎn)發(fā)現(xiàn),補(bǔ)充活性肽可增加大鼠對氮的消化與吸收功能。綜上所述,將蛋白質(zhì)水解成多肽更能促進(jìn)其利用率與生物功效,但控制好水解度非常關(guān)鍵。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,一般水解后分子量在2.5kd~3.5kd之間,多肽的抗氧化能力最強(qiáng)。由于每種蛋白質(zhì)的性質(zhì)不同,因此控制蛋白水解條件的因素也不同,本研究前期對星蟲蛋白水解性質(zhì)與活性的關(guān)系進(jìn)行了研究,最終確定10.2%作為比較適合的水解度,從蛋白質(zhì)電泳圖譜上看到水解后分子量在1.0kd~4.1kd之間。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,補(bǔ)充低劑量星蟲肽組RBC、Hb含量和HCT水平比補(bǔ)充生理鹽水組和星蟲蛋白組高。運(yùn)動組上述指標(biāo)相對安靜組提高更明顯,補(bǔ)充高劑量星蟲肽對這些指標(biāo)的影響不如補(bǔ)充低劑量大。研究結(jié)果表明,無論給安靜組還是給運(yùn)動組SD大鼠補(bǔ)充低劑量星蟲肽均能提高其RBC、Hb含量及HCT等,故推測補(bǔ)充星蟲肽可以改善大鼠血液常規(guī)指標(biāo)。星蟲肽中可能含有促使紅細(xì)胞表達(dá)上調(diào)的因子,在運(yùn)動中激發(fā)表達(dá)更明顯。另外,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在運(yùn)動中補(bǔ)充高劑量星蟲肽組紅細(xì)胞變化不如低劑量組明顯,其原因目前尚不清楚,有待進(jìn)一步研究。在機(jī)體內(nèi)SOD、GSH-PX是抗氧化系統(tǒng)中重要的酶,在清除自由基方面起到非常關(guān)鍵的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,無論安靜組還是運(yùn)動組,補(bǔ)充高、低劑量星蟲肽均能促使大鼠血清和肝組織SOD、GSH-PX活性增加,尤其在運(yùn)動組中,SOD、GSH-PX活性提高更明顯;LPO含量是反映脂質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo),在高負(fù)荷運(yùn)動中機(jī)體的脂質(zhì)過氧化水平會顯著提高,從肝組織LPO含量來看,生理鹽水、星蟲蛋白安靜組LPO水平顯著低于生理鹽水、星蟲蛋白運(yùn)動組,說明運(yùn)動造成的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)較明顯,但高、低劑量星蟲肽運(yùn)動組明顯低于生理鹽水組與蛋白質(zhì)運(yùn)動組,這與SOD、GSH-PX活性顯著提高有直接關(guān)系,抗氧化酶能清除脂質(zhì)過氧化物,并阻止脂質(zhì)過氧反應(yīng),這是補(bǔ)充星蟲肽大鼠LPO水平較低的主要原因;另外,我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)星蟲肽在體外具有顯著抑制亞油酸自氧化作用,這可能也是補(bǔ)充星蟲肽能使SD大鼠肝組織LPO含量減少的原因之一。NOS活性主要與組織缺血有關(guān),局部組織缺血會導(dǎo)致NOS活性增加,從而引起血液NO含量急劇增加,而NO是血管內(nèi)皮細(xì)胞上