條斑紫菜藻紅蛋白粗提方法的研究

條斑紫菜藻紅蛋白粗提方法的研究

藻膽蛋白質(zhì)包括藻紅蛋白（pe）、藻藍(lán)蛋白（pc）和變藻藍(lán)蛋白（apc）。它們是一些藻類的天然色素，具有良好的滲透性、鮮艷的顏色和明亮的光澤性質(zhì)。條斑紫菜(Porphyrayezoensis)是我國最主要的栽培紅藻之一,富含藻紅蛋白。多年研究表明,藻紅蛋白用途廣泛,可作為色素添加于食品、化妝品、保健品、藥品、紡織品、洗滌劑以及噴泉中,或制成熒光標(biāo)記探針,已在CyanotechCorporation、MartekBioscience、PROzymeInc.等公司出售,價(jià)格昂貴,其對人大腸癌、乳腺癌、口腔上皮癌、肝癌等細(xì)胞具光動力體外殺傷作用。藻膽蛋白還具抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、消炎、護(hù)肝、護(hù)神經(jīng)、抗紫外線、減緩動脈硬化、激活表皮生長因子等保健功效,甚至在光學(xué)信息存儲與處理、快速光電探測、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等方面也有潛在的用途。海藻在生長過程中除了培養(yǎng)條件如營養(yǎng)鹽會影響其藻膽蛋白含量外,收割后的海藻體的加工方法也會在很大程度上決定其內(nèi)含物的得失比例,因此處理海藻體的工藝方法在藻膽蛋白制備過程中很值得研究。海藻藻膽蛋白常規(guī)制備包括藻體破碎,蛋白粗提和純化3個(gè)步驟,其它制備方法有免疫吸附法和基因工程法,免疫吸附法是先制備抗PC多克隆抗體,再用親和層析純化PC;基因工程法用寡聚作用、生物特異識別功能域等重組C-PC,此外還有一些小量快速制備蛋白用于檢測的簡單方法。免疫吸附和基因工程等方法成本高,技術(shù)難度大。常規(guī)方法使用效果因材而異,其中純化階段成本高,時(shí)間長,產(chǎn)率低,是制備的瓶頸。本實(shí)驗(yàn)在蛋白粗提階段深入研究,從提高粗提效果,減輕純化壓力的角度,來探討藻紅蛋白制備方法。1材料和方法1.1溶液制備和密封條斑紫菜(Porphyrayezoensis)葉狀體于2009年3月采自江蘇省呂泗紫菜栽培海區(qū)。藻體用清潔海水洗凈,10℃下陰干后,密封置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩＠仓Z購自江西南昌白云藥業(yè)有限公司;其他試劑均購自國藥集團(tuán),為分析純。高速冷凍離心機(jī)(Supra22k)為HanilScience公司產(chǎn)品。紫外分光光度計(jì)(Ultrospec2000)為PharmaciaBiotech公司產(chǎn)品。1.2磷酸鹽緩沖液緩沖液緩沖液ph值稱取20g凍干條斑紫菜,用400mL50mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8,含1mmol/LEDTA,10mg溶菌酶)浸泡過夜,搗碎,4℃在10000r/min離心下20min,取上清。1.2.1活性炭活性炭法取1.2中制備的上清150mL,分成5組,每組30mL,分別加入2、1.5、1、0.5、0mg活性炭,4℃放置4h,紗布過濾,離心取上清。將每組上清各取20mL,平均分裝成5管,每管加入1.6、1.2、0.8、0.4、0mL的0.1%利凡諾試劑溶液,4℃放置4h,離心取上清。1.2.2活性炭的添加量取1.2中制備的上清108mL,分成2個(gè)平行組,每組設(shè)9個(gè)梯度,分別加入300、240、120、60、30、24、12、6、0mg活性炭,4℃放置4h,紗布過濾,離心取上清。1.3物理方法如ph、溫度和濕度。粗提紅蛋白稱取200g凍干條斑紫菜,用1L磷酸鹽緩沖液浸泡,過夜,搗碎,離心取上清。1.3.1ph的影響取1.3中制備的上清120mL,分成6組,每組20mL,分別調(diào)節(jié)pH至3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4,靜置3h,離心,沉淀用適量50mmol/L磷酸鹽緩沖液溶解,上清和沉淀分別掃描吸收光譜。1.3.2吸光度測定取1.3中制備的上清,倍比稀釋,即用50mmol/L磷酸鹽緩沖液分別稀釋至原溶液的1/2,1/4,1/8,1/16,1/32,連同原液共6組,每組13.5mL,均加至45%硫酸銨飽和度,調(diào)節(jié)pH至6.8,靜置2h,離心取沉淀,用5mL磷酸鹽緩沖液溶解,測量吸光值。1.3.3%硫酸銨飽和度取1.3中制備的上清90mL,分成6組,每組15mL,均加至45%硫酸銨飽和度,調(diào)pH至10.3、9.8、9.3、8.8、8.3、7.8、7.3、6.8、6.3、5.8、5.3、4.8,靜置2h,離心取沉淀,用5mL50mmol/L磷酸鹽緩沖液溶解,測吸光值。1.3.4沉淀液的制備取1.3中制備的部分上清加至45%硫酸銨飽和度,離心后沉淀用緩沖液溶解。量取30mL溶解液,分裝成10管,于25℃、30℃、35℃、40℃和45℃下分別放置15min和30min,離心取上清,測吸光值。1.3.5離心沉淀率的測定取1.3中制備的上清30mL,分成2個(gè)平行組,每組15mL,均加至45%硫酸銨飽和度,調(diào)pH至6.8,靜置過夜,均分別用1000、3000、5000、7000、9000和11000r/min在4℃下依次離心取沉淀,用5mL緩沖液溶解,測吸光值。1.4計(jì)算蛋白質(zhì)純度和含量的方法藻紅蛋白吸收光譜純度計(jì)算參考SIEGELMAN等的方法。藻紅蛋白含量計(jì)算參考高洪峰的方法。2結(jié)果2.1原液純度對檢測效果不明顯破碎液用活性炭與利凡諾共同處理后,溶液中PE純度變化在0.20～0.50之間,與原液純度(0.45)相比效果不明顯。經(jīng)F檢驗(yàn),不同質(zhì)量活性碳處理對純度影響無顯著性差異,經(jīng)q檢驗(yàn)(α=0.05),不同含量利凡諾處理對純度影響具顯著性差異,只有0.4mL與0mL(即對照組)兩組無顯著性差異(圖1)。2.2處理前后兩組患者同純度上升的比較破碎液單獨(dú)用活性碳處理后,溶液中PE純度隨活性碳量增加先降后升,在30mg處理量時(shí)達(dá)到與處理前同樣純度,此后純度逐漸上升,且每組結(jié)果經(jīng)q檢驗(yàn)(α=0.05)均與前后有顯著性差異。產(chǎn)率變化差異很大,在120mg處理量時(shí)最高,該最高值與對照組,60mg和240mg結(jié)果經(jīng)q檢驗(yàn)(α=0.05)無顯著性差異,因此理想處理量為60mg活性碳(圖2)。2.3最佳沉淀純度等電點(diǎn)梯度沉淀后,沉淀和上清中藻紅蛋白純度均有下降,溶液中最高純度出現(xiàn)在pH為4.2和4.4時(shí),均為0.41,沉淀中最高純度出現(xiàn)在pH為4.1時(shí),也為0.41(圖3)。2.4濃度梯度效應(yīng)鹽析所得藻紅蛋白純度和產(chǎn)率隨鹽析前溶液濃度降低而降低,未稀釋溶液鹽析后純度為1.35,得率為81.7%(圖4)。2.5ph梯度在不同的pH下鹽析,藻紅蛋白純度大致呈拋物線變化,最高值出現(xiàn)在pH6.8,為1.35(圖5)。2.6溫度梯度藻紅蛋白鹽析液經(jīng)不同溫度處理后,純度反而下降,且與溫升成反比(圖6)。2.7差速離心的梯度硫酸銨沉淀后,通過不同轉(zhuǎn)速可把不同純度的藻紅蛋白分離。低轉(zhuǎn)速可得到較高純度的藻紅蛋白,最高達(dá)到1.42,但得率有所損失(圖7)。3藻紅蛋白的純化條斑紫菜藻紅蛋白粗提最常用的試劑是硫酸銨,但應(yīng)用于其他藻膽蛋白的沉淀劑還有丙酮、活性炭和利凡諾等。丙酮用于螺旋藻藻膽蛋白特殊處理,活性炭是良好的吸附劑可去除水中的毒素和重金屬,但其對藻膽蛋白的作用效果尚無報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)顯示活性碳的使用可部分提高條斑紫菜破碎液中藻紅蛋白的純度,但其強(qiáng)力吸附作用會使蛋白得率有所下降。利凡諾在純化藻紅蛋白中的使用更為廣泛,可沉淀Porphyridiumcruentum和Nostocsp.的藻膽蛋白,經(jīng)過分步沉淀,甚至能獲得高純度的Spirulina(Arthrospira)fusiformisCPC(3.90)和ArthronemaafricanumCPC(3.00)。可本實(shí)驗(yàn)中盡管設(shè)置了廣泛的利凡諾梯度,卻使藻紅純度有降無升,這與Porphyridiumcruentum中描述現(xiàn)象相反,表明利凡諾法不適合條斑紫菜藻紅蛋白粗提。湯朝輝等將鈍頂螺旋藻破碎液的pH調(diào)至3.5,經(jīng)攪拌、離心得到了天藍(lán)色的藻膽蛋白膏。本文實(shí)驗(yàn)顯示藻紅蛋白確實(shí)對pH敏感,但單獨(dú)通過等電點(diǎn)沉淀無法提純,而在硫酸銨鹽析過程中輔以pH調(diào)節(jié)才能獲得高的純度和產(chǎn)率。筆者以往研究中對條斑紫菜設(shè)置了1∶40,1∶20,1∶10,1∶5(