水產(chǎn)動(dòng)物病毒病的分離純化研究進(jìn)展

水產(chǎn)動(dòng)物病毒病的分離純化研究進(jìn)展

病毒提取包括各種物理和化學(xué)方法，在不破壞和維持病毒的前提下，清除主細(xì)胞成分和其他非病毒雜質(zhì)，并提取高純度集中的病毒樣本。病毒提純是病毒學(xué)研究的重要前提,病毒微細(xì)形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究、病毒抗原蛋白的分離提純、病毒的化學(xué)成分及其遺傳物質(zhì)DNA或RNA的詳細(xì)研究都需要高純度的病毒樣品。由于病毒的生長(zhǎng)特性及理化學(xué)性質(zhì)不同,其寄生的宿主也不同,因此提純方法也不盡一致。以往使用的沉淀法,是從稀釋的懸浮液中濃縮病毒;由于病毒粒子表面攜帶特定的電荷群,所以也可采用層析法提純病毒。此外,兩相溶劑間分配系數(shù)法、紅細(xì)胞吸附法和電泳法,也是提純病毒的常用方法。這些方法都比較簡(jiǎn)單、溫和,并且對(duì)實(shí)驗(yàn)室的條件要求不高,所獲得的純化病毒能夠滿足一般的實(shí)驗(yàn)要求。但是,分子水平方面的研究往往需要高度純化的病毒,所以又出現(xiàn)了細(xì)胞培養(yǎng)的方法,細(xì)胞培養(yǎng)作為擴(kuò)增病毒的一種手段,為病毒的分離純化提供足夠量的病毒,然后通過(guò)超速離心得到高度純化的病毒,是分離提純病毒的有效方法。但是由于建立細(xì)胞系存在一定困難,大部分魚蝦貝類病毒分離純化的方法仍然是對(duì)動(dòng)物組織樣品直接離心提取。1光皮質(zhì)病病毒分離和純化魚類屬于水生脊椎動(dòng)物,為建立細(xì)胞系、分離富集病毒,再進(jìn)一步離心得到純化病毒,國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者作了大量工作。20世紀(jì)60年代,由Wolf和Quimby建立了世界上第1個(gè)魚類細(xì)胞系,即虹鱒魚生殖腺細(xì)胞系。此后,魚類的細(xì)胞培養(yǎng)研究進(jìn)展十分迅速(于淼等2003)。據(jù)Fryer等(1994)統(tǒng)計(jì),到1994年為止,至少已建立了159株魚類細(xì)胞系。自Wolf等(1959)首次利用虹鱒魚生殖腺細(xì)胞系分離出第1個(gè)魚類病毒——傳染性胰壞死病毒(IPNV)以來(lái),目前,世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了50余種魚類病毒(陳懷青1990)。1965年,Jensen用虹鱒魚生殖腺細(xì)胞系細(xì)胞研究了虹鱒病毒性出血性敗血癥(VHS)病毒的特性。1971年,Fijan等用鯉魚卵巢原代培養(yǎng)細(xì)胞分離了鯉魚春季病毒血癥病毒(SVCV),而后又從黑頭軟口鰷尾柄(FHM)細(xì)胞中分離出彈狀病毒。1971年,Wolf和Darlington用云斑叉尾蛔細(xì)胞系分離出斑點(diǎn)叉尾魚回病毒病(CCVD)的病毒。1988年,童裳亮等利用虹鱒脾細(xì)胞系從病魚中分離出魚傳染性胰壞死病毒。長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所和中國(guó)科學(xué)院病毒所通過(guò)草魚腎臟組織的細(xì)胞培養(yǎng)分離鑒定了草魚出血病病原——魚呼腸弧病毒(錢華鑫等1991)。陳燕燊等(1999)通過(guò)鰻鱺性腺細(xì)胞系分離純化出鰻鱺開口病病毒。Zhang等(1999)將虹彩病毒Ranagryliovirus接種在鯉魚上皮瘤(EPC)細(xì)胞系中,觀察病毒的形態(tài)發(fā)生,對(duì)其進(jìn)行了鑒定分類。Chang等(2001)建立了鱸魚細(xì)胞系,研究了其對(duì)虹彩病毒、雙RNA病毒、呼腸弧病毒、棒狀病毒和野田村病毒的敏感性,證明該細(xì)胞系適合作為分離各種魚病病毒的載體。李東等(2005)將海水鱸魚和淡水鱘魚的病魚腦組織浸出液接種到SSN-1,傳到第3代后,出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變(CPE),收獲細(xì)胞分離物并凍存。通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)分離的病毒不僅純度高,而且保種方便,但我國(guó)海水魚細(xì)胞系較少,所以對(duì)于一般海水魚病毒來(lái)說(shuō)仍然通過(guò)離心方法獲得。日本吉水守(1998)用濾膜過(guò)濾法純化牙鲆淋巴囊腫病毒(LCDV),建立ELISA診斷技術(shù),但并未發(fā)表純化病毒的照片。曲凌云(2001)用常規(guī)方法處理病料,經(jīng)差速離心后,雖然得到了LCDV,但病毒數(shù)量和純度均不理想。程開敏(2001)用常規(guī)的低速蔗糖密度梯度離心提取,也沒(méi)有獲得大量病毒。劉允坤等(2002)通過(guò)不同的樣品處理和離心方法,發(fā)現(xiàn)了影響淋巴囊腫病毒(LCDV)得率和純度的因子,通過(guò)消除該因子并結(jié)合計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)程序,應(yīng)用差速離心和蔗糖低-高速離心相結(jié)合的方法建立了牙鲆淋巴囊腫病毒快速分離技術(shù)。宋曉玲等(2003)利用差速離心和蔗糖密度梯度離心技術(shù)分離了牙鲆淋巴囊腫病的病原——淋巴囊腫病毒。2對(duì)克氏原螯蝦的毒力對(duì)蝦屬于水生無(wú)脊椎動(dòng)物,而水生無(wú)脊椎動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)比較困難,原代培養(yǎng)細(xì)胞不能形成單層,或即使形成單層,但細(xì)胞不分裂,難以進(jìn)行傳代。因而,至今沒(méi)有得到對(duì)蝦的連續(xù)性細(xì)胞系。所以通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)達(dá)到分離對(duì)蝦病毒的目標(biāo)目前還不能實(shí)現(xiàn),但是仍然有很多科研工作者進(jìn)行了有益的探索。Chen等(1989)在2×L-15+20%小牛血清+10μg/ml鏈霉素+100IU/m青霉素,溫度為28±1℃的條件下培養(yǎng)斑節(jié)對(duì)蝦的淋巴細(xì)胞,以研究斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒(MBV)的感染。岳玉環(huán)等(1997)選用鯉魚上皮乳狀瘤細(xì)胞(EPC)和虹鱒肝細(xì)胞(R1),對(duì)新發(fā)現(xiàn)的副粘病毒樣病毒進(jìn)行細(xì)胞分離與培養(yǎng)。結(jié)果表明,對(duì)蝦副粘病毒樣病毒可在這兩種魚類傳代細(xì)胞中復(fù)制。黃倢(1998)對(duì)該結(jié)果提出了商榷意見,提示結(jié)果中的副粘病毒樣病毒可能是對(duì)蝦的立克次氏體。Lu等(1991)在進(jìn)行對(duì)蝦細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)觀察到細(xì)胞存在彈狀病毒,分離到了傳染性皮下及造血組織壞死病病毒(IHHNV)。Tapay等(1997)利用藍(lán)對(duì)蝦和萬(wàn)氏對(duì)蝦的淋巴器官的細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行對(duì)蝦無(wú)包涵體桿狀病毒(NOSV)的定量分析研究,為病毒的鑒定和感染提供了簡(jiǎn)捷方便的方法。苗宏志等(2000)利用培養(yǎng)的中國(guó)對(duì)蝦淋巴器官細(xì)胞研究了中國(guó)對(duì)蝦皮下及造血組織壞死桿狀病毒(HHNBV)的增殖。汪岷等(2000)利用中國(guó)對(duì)蝦淋巴組織進(jìn)行球形病毒超微結(jié)構(gòu)的研究。Loh等(1990)曾報(bào)道傳染性皮下及造血組織壞死病病毒(IHHNV)可以在鯉魚上皮乳頭狀細(xì)胞上增殖。但該篇文章的結(jié)論已被推翻,該病毒后被證實(shí)是鯉魚春季病毒血癥病毒(馮書營(yíng)等2003)。目前分離對(duì)蝦類病毒的主要方法是密度梯度離心法,主要有差速離心、蔗糖密度梯度離心、氯化銫密度梯度離心和酒石酸鉀-甘油密度梯度離心等。為了更好的提純病毒,更多是將以上幾種方法聯(lián)合使用,以達(dá)到更好的效果。黃倢等(1995)運(yùn)用蔗糖密度梯度法和NaBr密度梯度法分離提純出對(duì)蝦皮下及造血組織壞死桿狀病毒(HHNBV),對(duì)純化的病毒進(jìn)行了超微結(jié)構(gòu)、紫外吸收、核酸類型及多肽SDS的研究。薛清剛等(1996)采用一種改進(jìn)的酒石酸鉀-甘油密度梯度離心法,對(duì)對(duì)蝦肝胰腺細(xì)小樣病毒(HPV)進(jìn)行純化。結(jié)果表明,用酒石酸鉀-甘油密度梯度離心法,可獲得良好的病毒純化效果,通過(guò)電子顯微鏡觀察、提取病毒核酸用不同核酸酶處理并結(jié)合電泳等方法,對(duì)病毒的基本生物物理和生物化學(xué)特性做出了鑒定。陳細(xì)法等(1997)通過(guò)低溫離心,低溫超速離心和連續(xù)蔗糖密度梯度離心的方法獲得了純凈的淋巴樣細(xì)胞核型桿狀病毒(LNBV)的病毒懸液。Bonami等(1997)應(yīng)用蔗糖密度梯度離心法初步提純對(duì)蝦桃拉病毒(TSV),然后應(yīng)用氯化銫密度梯度離心法進(jìn)一步提純了病毒。謝數(shù)濤等(2000)取患白斑癥的瀕死斑節(jié)對(duì)蝦Penaeusmondon的表皮、鰓和胃,勻漿后通過(guò)蔗糖密度梯度離心和蔗糖墊層差速離心兩種方案,提純出WSSV,觀察了病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)。徐洪濤等(2000)為進(jìn)一步研究病毒的基本特性包括其基因組結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn),應(yīng)用氯化銫密度梯度超速離心技術(shù)成功地獲得純化的中國(guó)對(duì)蝦非包涵體型桿狀病毒(PcNOBV)核衣殼。孫磊等(2004)從市售的甲殼上帶有白斑的冷凍斑節(jié)對(duì)蝦中,通過(guò)蔗糖密度梯度離心法提取到一種桿狀病毒,利用電鏡負(fù)染對(duì)其超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。Nadala等(1998)為了從形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和基因等角度比較來(lái)自3個(gè)不同地域的WSSV的差異性,通過(guò)低速離心、多次高速離心和氯化銫超速離心相結(jié)合的方法分離提純了WSSV。美國(guó)Lightner實(shí)驗(yàn)室也曾多次試圖分離包涵體,但均未獲成功(Bruce1991;Marietal.1990;Poulosetal.1993);Chang等(1993)報(bào)道在氯化銫超速離心法分離病毒過(guò)程中得到了部分包涵體;楊豐等(1995)為分離草蝦桿狀病毒的包涵體,利用蛋白酶抑制劑防止包涵體被破壞,通過(guò)差速和高速離心得到了高純度斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒(MBV)包涵體;王金星等(1997)通過(guò)差速和超速離心,進(jìn)行了病原的純化,得到了長(zhǎng)度為380～410nm直徑為90～100nm的桿狀病毒顆粒。3超微結(jié)構(gòu)的觀察作為水生無(wú)脊椎動(dòng)物的貝類目前也尚未建立起細(xì)胞系,從而給貝類病毒病的研究帶來(lái)很大的限制?，F(xiàn)在分離貝類病毒的主要方法同樣主要是密度梯度離心。王崇明等(2002)運(yùn)用差速離心和蔗糖密度梯度離心相結(jié)合的方法,從具典型發(fā)病癥狀的櫛孔扇貝Chlamysfarreri體內(nèi)提純了一種球形病毒,應(yīng)用電鏡技術(shù)進(jìn)行了超微結(jié)構(gòu)的觀察。沈輝等(2006)運(yùn)用差速離心、蔗糖墊超速離心與CsCl密度梯度離心相結(jié)合的方法,從江蘇海域異常發(fā)病死亡的文蛤MeretrixmeretrixLusoria組織中提出一種病毒顆粒,運(yùn)用原子力掃描顯微鏡對(duì)提純病毒進(jìn)行了表面結(jié)構(gòu)觀察。王斌等(2003)通過(guò)PEG透析獲得病毒粗提液,然后通過(guò)蔗糖密度梯度離心法獲得了養(yǎng)殖貽貝中的一種球形病毒。4差速離心法水生動(dòng)物病毒病具有潛伏期長(zhǎng)短不一、癥狀復(fù)雜多變、傳染性強(qiáng)和導(dǎo)致高死亡率的特點(diǎn),且病原個(gè)體微小,侵染動(dòng)物后在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,抗菌素對(duì)其無(wú)作用。而化學(xué)藥物(消毒劑等)在殺滅病毒前,就可能使宿主動(dòng)物受損或致死,可見病毒是危害非常嚴(yán)重的一類病原。而對(duì)于一種病毒的認(rèn)識(shí),則首先應(yīng)該做好分離純化工作,只有這樣才能更好的認(rèn)識(shí)該病毒,并進(jìn)行更深入的研究。就目前的研究手段來(lái)說(shuō),魚、蝦、貝等水產(chǎn)動(dòng)物病毒分離純化的主要方法是超速離心法,由于分離純化病毒的研究目的不同,對(duì)病毒的純度要求也不同,具體的方法有所差異。通過(guò)差速離心法往往可以獲得病毒的粗提液,能夠滿足人工感染試驗(yàn)和觀察病毒超微結(jié)構(gòu)的要求,但是如果要研究病毒的基因組結(jié)構(gòu)或者進(jìn)行更深入的研究,必須用超速離心法或者差速離心和超速離心相結(jié)合的方法得到更加純的病毒。由于病毒感染部位不同,感染部位的組織成分也有所不同,如扇貝的肝胰腺由于油脂含量過(guò)多就會(huì)對(duì)病毒的提純?cè)斐珊艽笥绊?。另?由于病毒純化步驟中的各個(gè)關(guān)鍵參數(shù)(包括緩沖液選擇、離心時(shí)間、離心轉(zhuǎn)速和梯度液配制等)會(huì)對(duì)病毒的分離純化效果產(chǎn)生很大的影響,因此目前通過(guò)超速離心法提純病毒并沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞培養(yǎng)作為分離病毒的一種手段,可以得到含量很高的病毒,能夠滿足分子水平等方面的研究,而且可以通過(guò)傳代培養(yǎng)進(jìn)行保種,能夠在病毒的分離和純化方面發(fā)揮很重要的作用。對(duì)于魚類而言,