鎘鹽脅迫下牙肝臟全蛋白和差異蛋白質(zhì)的提取、分離和鑒定

鎘鹽脅迫下牙肝臟全蛋白和差異蛋白質(zhì)的提取、分離和鑒定

1蛋白質(zhì)組織化學(xué)建立能夠有效提取和分離動(dòng)植物和微生物組織細(xì)胞中的完整蛋白質(zhì)，并確定蛋白質(zhì)的方法是目前開展蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)問題之一。雙向凝膠電泳(2D)和雙向液相色譜分離(2D-LC)技術(shù)是目前開展蛋白質(zhì)組學(xué)研究的常用分離技術(shù),但前者易受細(xì)胞組織內(nèi)干擾物影響,例如核酸、多糖和脂類物質(zhì);而后者在分離過程中,易丟失部分蛋白質(zhì),難獲取全蛋白。目前,組織細(xì)胞全蛋白的常用破碎技術(shù)有丙酮沉淀法、裂解法、凍溶法和酶解法等。針對(duì)生物材料來源不同,優(yōu)化提取組織細(xì)胞全蛋白和減少內(nèi)外干擾物是開展蛋白質(zhì)組學(xué)必須克服的難題。至今,相關(guān)的研究已有大量且詳細(xì)的研究報(bào)道,但尚未建立一套較為成熟、重復(fù)性高和廣譜性好的細(xì)胞組織全蛋白質(zhì)提取方法。環(huán)境蛋白質(zhì)組學(xué)是目前環(huán)境毒理學(xué)中最有挑戰(zhàn)性和前瞻性的領(lǐng)域之一,相關(guān)的研究?jī)H僅處于起步階段。環(huán)境蛋白質(zhì)組學(xué)能同時(shí)篩選與鑒定出由各類重金屬和有機(jī)污染物,在單一和聯(lián)合脅迫效應(yīng)環(huán)境中所誘導(dǎo)的多種蛋白指示物,為揭示復(fù)雜的毒理機(jī)理和評(píng)價(jià)危害性提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)以牙鲆肝臟組織為材料,選用差速離心和雙向凝膠電泳非在線聯(lián)用技術(shù),高效提取和優(yōu)化分離受鎘鹽脅迫前后的牙鲆肝臟全蛋白,為后續(xù)選用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選及鑒定監(jiān)測(cè)鎘污染程度及危害性的蛋白質(zhì)標(biāo)志物提供可信度較高的結(jié)果。2實(shí)驗(yàn)部分2.1實(shí)驗(yàn)試劑和測(cè)牙設(shè)備雙向電泳儀(北京六一儀器廠);REFLEX型MALDI-TOF質(zhì)譜儀(德國(guó)Bruker公司);各類冷凍離心機(jī)(貝克曼公司)。載體兩性電解質(zhì)(Amersham公司),pH3～10;胰蛋白酶(Promega公司);基質(zhì)α-氰-4-羥肉桂酸(美國(guó)ICN生物醫(yī)學(xué)公司);碘乙酰胺(Sigma公司);丙稀酰胺、甲叉丙稀酰胺等試劑均購(gòu)自上海生物工程技術(shù)有限公司;勻漿緩沖液:0.25mol/L蔗糖,1mmol/LEDTA,50mmol/LTris-HCl,1mmol/LPMSF(pH=7.4);樣品裂解液:7mol/L尿素,4%CHAPS,2mol/L硫脲,60mmol/LDTT,10mmol/LTris,1mmol/LEDTA,1mmol/LPMSF,0.5%載體兩性電解質(zhì),0.0002%溴酚蘭。分裝,-20℃保存待用;雙向電泳和銀染方法中所需試劑均參考文獻(xiàn)。實(shí)驗(yàn)所需的牙鲆均購(gòu)于廈門人工養(yǎng)殖場(chǎng)。使用前,牙鲆需在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)一周。實(shí)驗(yàn)前72h開始停止喂食,防止飼料中微量重金屬影響牙鲆的正常代謝。隨機(jī)選擇牙鲆10只,并隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組牙鲆置于人工模擬構(gòu)建的CdCl2(10mg/L)的污染環(huán)境中,繼續(xù)飼養(yǎng)72h。對(duì)照組牙鲆置于在人工海水中繼續(xù)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前,選用剪斷脊椎處死方式處理牙鲆,并迅速解剖,獲取牙鲆肝臟,用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液直接沖洗,并保存在-80℃以備使用。2.2實(shí)驗(yàn)步驟及步驟取實(shí)驗(yàn)組(受鎘鹽脅迫)5條牙鲆的肝臟(POL)各20g,混合后共100g。對(duì)照組的POL取法同上。加入等體積勻漿緩沖液,在冰浴條件下研磨制成勻漿。隨后,以400×g的相對(duì)離心力離心10min,去除未磨碎的組織和細(xì)胞,收集上清液Ⅰ,備用。選用下列差速離心技術(shù),分步收集蛋白沉淀物,并選用2D進(jìn)行有效分離,具體實(shí)驗(yàn)步驟(始終維持在4℃環(huán)境下):(1)1000×g沉淀分離:以1000×g的相對(duì)離心力離心上清液Ⅰ10min,收集沉淀蛋白和上清液Ⅱ。該沉淀物主要是細(xì)胞核,用勻漿緩沖液洗滌兩次,最后收集沉淀樣品備用(-20℃保存,下同);(2)12000×g沉淀的分離:以12000×g的相對(duì)離心力離心上清液Ⅱ30min,收集沉淀蛋白和上清液Ⅲ。選用勻漿緩沖液洗滌該沉淀蛋白兩次,最后收集沉淀樣品備用;(3)100000×g沉淀的分離:以100000×g的相對(duì)離心力離心上清液Ⅲ30min,收集沉淀蛋白質(zhì)和上清液Ⅳ。上清液Ⅳ中多數(shù)蛋白是胞漿蛋白,收集樣品,凍干備用;(4)上述所有收集的蛋白組分分別充分溶解于裂解液中,并選用100000×g的相對(duì)離心力離心蛋白樣品10min,分別收集上清液,稱為POL蛋白組分Ⅰ(1000×g沉淀蛋白)、POL蛋白組分Ⅱ(12000×g沉淀蛋白)、POL蛋白組分Ⅲ(100000×g沉淀蛋白)和POL蛋白組分Ⅳ(胞漿蛋白),并用于雙向電泳分離。2.3雙凝膠電泳分離條件2.3.1等電聚焦電泳在上樣之前,參考文獻(xiàn)先進(jìn)行預(yù)電泳。預(yù)電泳結(jié)束后,換上樣品液,在用Bradford法測(cè)定樣品液的總蛋白濃度后,以150μg總蛋白上樣,然后進(jìn)行等電聚焦電泳。2.3.2sds電泳按照SDS均一膠的配方配置11%膠濃度的凝膠。將平衡后的膠條轉(zhuǎn)移到SDS凝膠上,并在膠條上覆蓋一層含有溴酚蘭的0.5%瓊脂糖,在140V的恒定電壓下進(jìn)行電泳。待溴酚蘭前沿到達(dá)凝膠底端時(shí),停止電泳。2.4蛋白質(zhì)質(zhì)量檢測(cè)參照文獻(xiàn)的銀染方法進(jìn)行蛋白質(zhì)染色。染色后,利用掃描儀對(duì)SDS凝膠板進(jìn)行透射掃描。選用Melanie4Trial軟件進(jìn)行凝膠電泳圖譜中的蛋白質(zhì)總數(shù)和差異斑點(diǎn)分析與統(tǒng)計(jì)。用REFLEX型MALDI-TOF質(zhì)譜儀獲得各蛋白的肽質(zhì)量指紋圖,采用反射模式、正離子譜測(cè)定。激光波長(zhǎng)為337nm,質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加200次,用BRUKER肽混合物作外標(biāo)。選用常規(guī)PMF和數(shù)據(jù)庫比對(duì)技術(shù)直接鑒定差異蛋白質(zhì)。數(shù)據(jù)庫選擇MSDB,檢索基本條件參照文獻(xiàn)。3結(jié)果與討論3.1蛋白質(zhì)測(cè)定各組anie4t爾雅軟件的蛋白測(cè)定結(jié)果圖1是牙鲆受金屬鎘脅迫后,采取直接裂解法提取POL全蛋白質(zhì)的2D圖譜。從圖1可看出,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)分布趨勢(shì)基本一致,具有較好的重現(xiàn)性。采用Melanie4Trial軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目統(tǒng)計(jì)與分析,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組2D圖譜中的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目約為800個(gè),其中多數(shù)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的pI范圍集中在4.5～9.0之間,蛋白質(zhì)亞基的分子量在25～100kD之間,具有較高的分辨率,適合于后續(xù)蛋白質(zhì)鑒定。通過比對(duì)分析,可獲得11個(gè)差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn),其中高表達(dá)蛋白2個(gè)(A6和A11);上調(diào)蛋白6個(gè)(A1、A4、A7、A8、A9和A10);下調(diào)蛋白3個(gè)(A2、A3和A5)。這些差異蛋白斑點(diǎn)均與受鎘鹽誘導(dǎo)有關(guān),推測(cè)是牙鲆肝臟產(chǎn)生的應(yīng)激蛋白質(zhì)。3.2差速離心法高效提取牙肝臟全蛋白技術(shù)肝臟是動(dòng)物代謝的重要場(chǎng)所之一,具有各類復(fù)雜代謝途徑和含有豐富的蛋白質(zhì)。借鑒文獻(xiàn),選用2D分離法可獲得約近千個(gè)鼠肝臟全蛋白斑點(diǎn)數(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)選用直接裂解法提取POL全蛋白,但只獲取約800個(gè)蛋白斑點(diǎn)的2D圖譜。顯然,圖1中的全蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)偏少,不太適合進(jìn)一步深入開展POL蛋白質(zhì)組學(xué)研究,尤其不適合研究鎘鹽毒理學(xué)和篩選連續(xù)監(jiān)測(cè)流動(dòng)水體鎘污染程度的蛋白指示物。在系列比對(duì)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,建立了差速離心法高效提取牙鲆肝臟全蛋白技術(shù),具體實(shí)驗(yàn)步驟見圖2。圖2顯示了選用差速離心法使牙鲆肝臟中不同沉降系數(shù)的蛋白質(zhì)得到粗分離,減少高豐度蛋白的干擾和提高低豐度蛋白富集的效果,有助于開展牙鲆肝臟全蛋白組學(xué)研究和篩選差異蛋白質(zhì)。目前,常用于動(dòng)物肝臟全蛋白質(zhì)提取技術(shù)且適合于開展蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法有TCA/丙酮酸沉淀法、緩沖液法、裂解法及“鳥槍”蛋白質(zhì)組分析法等。但這些方法獲取肝臟全蛋白種類大都低于1500種,明顯少于本實(shí)驗(yàn)建立的差速離心提取技術(shù)。3.3蛋白斑線計(jì)數(shù)圖3是在鎘鹽脅迫下,牙鲆肝臟組分Ⅰ全蛋白和差異蛋白圖譜。采用Melanie4Trial軟件對(duì)圖解中的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析,可在亞細(xì)胞組分Ⅰ中獲得約380個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。比較圖3A(實(shí)驗(yàn)組)和圖3B(對(duì)照組),可獲得11個(gè)差異蛋白斑點(diǎn)。其中A1、A2、A3、A4、A6、A7和A8為上調(diào)蛋白,而A5、A9、A10和A11為下調(diào)蛋白。3.4電泳分中獲得的蛋白斑塊圖4是在鎘鹽脅迫下,牙鲆肝臟組分Ⅱ全蛋白和差異蛋白的2D圖譜。經(jīng)統(tǒng)計(jì)與分析后,發(fā)現(xiàn)亞細(xì)胞組分Ⅱ中獲得約550個(gè)蛋白斑點(diǎn)。比較圖4A(實(shí)驗(yàn)組)和圖4B(對(duì)照組)蛋白斑點(diǎn)分布和差異特性,可獲得13個(gè)差異蛋白斑點(diǎn),其中的A1和A4斑點(diǎn)為上調(diào)蛋白;A2、A3、A6、A7、A8、A9、A11和A12斑點(diǎn)為下調(diào)蛋白;A5、A10和A13為高表達(dá)蛋白(highexpressionproteins)。3.5比對(duì)分析結(jié)果圖5是在鎘鹽脅迫下,牙鲆肝臟組分Ⅲ的全蛋白和差異蛋白質(zhì)的2D圖譜。經(jīng)分析與統(tǒng)計(jì),可獲悉圖5顯示出約500個(gè)蛋白斑點(diǎn)。比對(duì)圖5A和圖5B結(jié)果,可進(jìn)一步獲悉兩圖之間約有14個(gè)差異蛋白斑點(diǎn)。其中的A10、A11和A14斑點(diǎn)為上調(diào)蛋白;A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A12和A13斑點(diǎn)為下調(diào)蛋白。3.6差異蛋白的篩選及鑒定通常認(rèn)為,細(xì)胞破碎液經(jīng)100000×g的相對(duì)離心力離心后所獲得的蛋白上清液視為細(xì)胞的胞漿蛋白。根據(jù)3.2節(jié)所描述的實(shí)驗(yàn)步驟和離心率可獲悉,牙鲆肝臟組分Ⅳ屬于胞漿蛋白質(zhì)。在鎘鹽脅迫下,所獲得牙鲆肝臟組分Ⅳ的差異蛋白質(zhì),視為金屬鎘脅迫牙鲆肝臟表達(dá)的差異胞漿蛋白。從圖6中可看出牙鲆肝臟組分Ⅳ含有約850個(gè)蛋白斑點(diǎn),其胞漿蛋白質(zhì)種類明顯高于其它牙鲆肝臟組分的蛋白質(zhì)種類,說明了牙鲆肝臟含有豐富的胞漿蛋白質(zhì)。比較圖6A和圖6B中的差異蛋白斑點(diǎn)分布情況和規(guī)律可獲悉,在鎘鹽脅迫下,牙鲆肝臟表達(dá)了16種差異蛋白,其差異蛋白總數(shù)目多于其它POL組分。其中高表達(dá)的蛋白質(zhì)為A1、A2、A4和A9;上調(diào)蛋白為A5、A6、A7、A10、A11和A14;下調(diào)蛋白為A3、A8、A12、A13、A15和A16。進(jìn)一步選用肽質(zhì)量指紋(PMF)圖譜和數(shù)據(jù)庫比對(duì)技術(shù)對(duì)上述54個(gè)差異蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),有3種同類差異蛋白,即共有51個(gè)不同的差異蛋白。在鑒定結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了一些文獻(xiàn)中已報(bào)道的與鎘鹽脅迫有關(guān)的蛋白(見表1)?？偨Y(jié)圖3～6中所顯示的蛋白斑點(diǎn)數(shù)目可獲悉,選用差速離心法分離牙鲆肝臟的全蛋白種類約2280個(gè),明顯高于直接裂解法(800個(gè)蛋白斑點(diǎn))的結(jié)果。雖然選用不同離心力分離POL亞細(xì)胞蛋白組分之間含有同一類蛋白,但只發(fā)現(xiàn)存在少量同類蛋白質(zhì),說明了選用差速離心法所獲取的POL全蛋白中只含有少量的同類蛋白質(zhì),推測(cè)所獲得的蛋白種類應(yīng)高于2000種,適合于開展POL蛋白質(zhì)組學(xué)研究。在鎘鹽脅迫下,同樣也獲取54種差異蛋白,其中只有3種同類差異蛋白,即鎘鹽脅迫牙鲆肝臟表達(dá)了51種差異蛋白,這也適合于篩選潛在的可用于研究金屬鎘毒理學(xué)和監(jiān)測(cè)流動(dòng)水體重金屬污染的蛋白質(zhì)指示物。顯然,差速離心結(jié)合雙向電泳技術(shù)顯著提高了牙鲆肝全蛋白的分離效率和差異蛋白的檢出率。由于動(dòng)物組織、細(xì)胞及卵等中蛋白質(zhì)種類間存在豐度差異,現(xiàn)有的全蛋白提取與分離技術(shù)不易通過單一的2D方法同時(shí)顯示高低豐度不同的蛋白質(zhì)。而本實(shí)驗(yàn)所建立的差速離心技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),不僅降低蛋白之間產(chǎn)生沉淀現(xiàn)象,而且還使許多低豐度蛋白得以富集和鑒定,從中獲取更多的蛋白種類。在蛋白的分離效率上明顯高于現(xiàn)有