哺乳動(dòng)物貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)

哺乳動(dòng)物貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)一．細(xì)胞貼壁的原理細(xì)胞分泌一種胞膜外膜基質(zhì)，這種細(xì)胞基質(zhì)能黏附固定在被支持物上（如培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿的底面）細(xì)胞的外表面。細(xì)胞主要通過(guò)表達(dá)其壁表面上的各種黏附的因子而與上述這些表面細(xì)胞及外源基質(zhì)發(fā)生結(jié)合。所以一個(gè)細(xì)胞的能否緊貼其壁既與此細(xì)胞及其本身所分泌各種細(xì)胞或外來(lái)源基質(zhì)分子的粘附能力高低及其細(xì)胞壁本身能夠表達(dá)出的這些黏附分子的種類(lèi)數(shù)量高低有關(guān)，也是與細(xì)胞培養(yǎng)用皿壁材料的特殊表面結(jié)構(gòu)有關(guān)。二．貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)1.

細(xì)胞的復(fù)蘇：（1）提前打開(kāi)超凈工作臺(tái)紫外滅菌30min；（2）提前打開(kāi)水浴鍋至37℃，預(yù)熱所用培養(yǎng)基。（3）在液氮中取出凍存的細(xì)胞，以“慢凍速溶”的原則把細(xì)胞放入37℃水浴鍋中，使細(xì)胞迅速融化，該過(guò)程在2min內(nèi)完成，以保持細(xì)胞的活力。細(xì)胞解凍后放在離心機(jī)中，1000rpm離心3-5min，離心結(jié)束小心棄上清，并用提前預(yù)熱的培養(yǎng)基吹打混勻細(xì)胞，在轉(zhuǎn)移至合適培養(yǎng)皿中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)即可。2.

貼壁細(xì)胞的傳代：（1）傳代前先在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)是否良好。（2）觀察細(xì)胞的匯合度是否達(dá)到70%-90%，細(xì)胞匯合度太低或太高都不利于細(xì)胞生長(zhǎng)。（3）在給細(xì)胞傳代時(shí)，首先棄去培養(yǎng)基，用pH為7.4的無(wú)菌的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗細(xì)胞2-3次，動(dòng)作要輕柔防止細(xì)胞脫落。（4）清洗完細(xì)胞后加入終濃度為0.25%的胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞，消化過(guò)程中把細(xì)胞放在顯微鏡下觀察，知道細(xì)胞被消化成一個(gè)個(gè)單獨(dú)的小圓球時(shí)加入培養(yǎng)基終止細(xì)胞消化（時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)影響細(xì)胞活性，時(shí)間太短會(huì)消化不完）。（5）消化下來(lái)的細(xì)胞吹打混勻后以1:3-5的比例分裝到新的培養(yǎng)皿中再加入足量的培養(yǎng)基繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。3.

貼壁細(xì)胞的凍存：（1）棄去培養(yǎng)基，用pH為7.4的無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗細(xì)胞2-3次，動(dòng)作要輕柔防止細(xì)胞脫落。（2）向清洗完的細(xì)胞中加入0.25%的胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞，整個(gè)過(guò)程在顯微鏡下觀察，直到細(xì)胞被消化成單獨(dú)的小圓球時(shí)加入培養(yǎng)基終止細(xì)胞消化。（3）消化下來(lái)的細(xì)胞按一下比例放入凍存管中：60%的胎牛血清（FBS）＋30%細(xì)胞懸液＋10%二甲基亞砜（DMSO）。（4）在凍存管中要標(biāo)注好細(xì)胞的名稱(chēng)、凍存時(shí)間、代數(shù)等信息。先放入負(fù)八十度冰箱冷藏十二小時(shí)后再把細(xì)胞取出放入液氮中保存。4.

貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染：（1）前一天先把細(xì)胞鋪進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，使得細(xì)胞匯合度達(dá)到60%-80%。（2）轉(zhuǎn)染前要把培養(yǎng)基換成沒(méi)有雙抗的培養(yǎng)基，以排除雙抗對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響。（3）去適量純培養(yǎng)基用于稀釋質(zhì)粒和lipo3000轉(zhuǎn)染試劑，再向稀釋完畢的質(zhì)粒中加入p3000，充分混勻。再將其加入至稀釋過(guò)的lipo3000中，輕柔吹打混勻混合液，室溫孵育20min。孵育結(jié)束后把質(zhì)粒-p3000-lipo3000混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕混勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6h，再更換成帶有雙抗的培養(yǎng)基即可。

三．常用的貼壁細(xì)胞細(xì)胞名稱(chēng)CHO-K1細(xì)胞293細(xì)胞vero細(xì)胞形態(tài)表皮細(xì)胞上皮細(xì)胞上皮細(xì)胞培養(yǎng)基Ham'sF12K（含2mML-谷氨酰胺，1.5g/LNaHCO3），10%胎牛血清MEM（含2mML-谷氨酰胺和Earle'sBSS，1.5g/LNaHCO3,0.1mM非必需氨基酸，1.0mM丙酮酸鈉），10%馬血清（熱滅活）MEM（含2mML-谷氨酰胺和Earle'sBSS，1.5g/LNaHCO3,0.1mM非必需氨基酸，1.0mM丙酮酸鈉），10%胎牛血清傳代吸去培養(yǎng)液。用0.25%(w/v)Trypsin-0.53mMEDTA洗一次，以去除血清（血清會(huì)抑制胰酶的活性）。加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)約5分鐘，直到細(xì)胞全部脫落。加6-8毫升培養(yǎng)液，用移液器把細(xì)胞吹散。加適量的細(xì)胞到新的培養(yǎng)器皿中。（以1：4到1：8為宜，傳代期間培養(yǎng)液更換1-2次）吸去培養(yǎng)液。用0.25%(w/v)Trypsin-0.53mMEDTA洗一次，以去除血清（血清會(huì)抑制胰酶的活性）。加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)約5分鐘，直到細(xì)胞全部脫落。加6-8毫升培養(yǎng)液，用移液器把細(xì)胞吹散。加適量的細(xì)胞到新的培養(yǎng)器皿中。（以1：2到1：4為宜，傳代期間培養(yǎng)液2-3天更換1次）吸去培養(yǎng)液。用0.25%(w/v)Trypsin-0.53mMEDTA洗一次，以去除血清（血清會(huì)抑制胰酶的活性）。加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)約5分鐘，直到細(xì)胞全部脫落。加6-8毫升培養(yǎng)液，用移液器把細(xì)胞吹散。加適量的細(xì)胞到新的培養(yǎng)器皿中。（以1:3至1:6為宜，傳代期間培養(yǎng)液每周更換2-3次）凍存95%培養(yǎng)液+5%DMSO凍存于液氮95%培養(yǎng)液+5%DMSO凍存于液氮95%培養(yǎng)液+5%DMSO凍存于液氮

四．貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用1.

細(xì)胞學(xué)研究：貼壁細(xì)胞培養(yǎng)可以為細(xì)胞學(xué)研究提供許多有用的信息，如細(xì)胞分裂、分化和轉(zhuǎn)化等。2.

疾病模型：通過(guò)培養(yǎng)患者的貼壁細(xì)胞，建立起與某些疾病相關(guān)的細(xì)胞模型，如癌癥等。3.

藥物篩選：通過(guò)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞測(cè)試藥物的療效和毒性，從而篩選出具有治療潛力的藥物。4.

基因編輯：為CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)等提供重要支持。

五．貼壁細(xì)胞展示封閉培養(yǎng)的細(xì)胞增殖緩慢，細(xì)胞折光性強(qiáng)，3%組在培養(yǎng)1