木霉對煙草疫霉生長的拮抗作用

木霉對煙草疫霉生長的拮抗作用

卷煙感染是引起黑煙疾病的唯一病因。它可能會影響種植在各種雜草上的香煙、香煙、煙霧彌漫、皮膚顏色的氣味、白煙等。嚴重的有害因素發(fā)生在卷煙植株，通常導(dǎo)致整個植株的死亡。這種疾病通常導(dǎo)致香煙植株的萎縮和死亡，并對牧草生產(chǎn)造成嚴重破壞。目前生產(chǎn)上用來防治煙草黑脛病的化學(xué)藥劑多為苯基酰胺類及乙磷鋁等內(nèi)吸性殺菌劑.為了克服因長期采用化學(xué)藥劑使病原菌產(chǎn)生抗藥性,以及環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留等弊端,研制高效且對環(huán)境安全的生物殺菌劑成為新一代農(nóng)藥研制的發(fā)展方向.目前已發(fā)現(xiàn)許多微生物對植物病原真菌具有拮抗作用,木霉菌(Trichodermaspp.)就是一類具有開發(fā)應(yīng)用前景的生防菌.本研究以煙草疫霉菌為靶標真菌,研究木霉菌對煙草疫霉菌的拮抗性和防治效果.1材料和方法1.1綠色木霉tviruse和煙草疫霉菌哈茨木霉(T.harzianum)菌株TGY040604,綠色木霉(T.viride)菌株TG050601、TG050609、TZ050610由福建農(nóng)林大學(xué)植保學(xué)院線蟲研究室分離、純化、保存.煙草疫霉菌由云南玉溪煙科所夏振遠老師饋贈.1.2對病原菌的培養(yǎng)采用傷根接種法進行致病性測定:用小刀刺入土壤中使植株部分根系受損,將50mL煙草疫霉菌游動孢子懸浮液(105個·mL-1)灌入土壤中,以灌等量滅菌水作為對照.28℃、相對濕度80%-90%下進行室內(nèi)培養(yǎng).每一處理3株煙苗,3次重復(fù).10-15d后檢查結(jié)果,并對病株進行再分離,以明確供試病原菌的致病性.1.3生育木菌的篩選1.3.1接種木霉和疫霉菌的相互作用參考程麗云的方法,采用直徑6mm的打孔器打取木霉菌和煙草疫霉菌的菌餅,在距離PSA平板中心2.5cm的相對2點上分別接種木霉和疫霉菌,以不接木霉菌、只接疫霉菌為對照,置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).每一處理3次重復(fù).接種后第2天開始逐日測量兩接種點連線上疫霉菌的菌落半徑,計算抑菌率.當兩菌落接觸后,觀察記載木霉菌對病原菌的抑制、包圍、侵入并占領(lǐng)疫霉菌生長空間的過程,挑取交接部位菌絲在顯微鏡下觀察木霉菌與疫霉菌的相互作用.1.3.2接種木霉餅后接種疫霉菌餅參考文獻的方法,在培養(yǎng)皿的底和蓋上倒入等量(15mL)PSA培養(yǎng)基,制成平板.抑菌試驗組在培養(yǎng)皿蓋上接種活化培養(yǎng)4d的木霉菌餅(直徑6mm),在其底上接種疫霉菌餅;對照組只在皿底接疫霉菌而蓋上不接木霉;將培養(yǎng)皿倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每處理重復(fù)3次.在接種后24、48、72h分別測量疫霉菌的菌落直徑,計算抑菌率.1.3.3psa培養(yǎng)基的制備參考朱天輝等的方法,將木霉菌接于PSA斜面上培養(yǎng)6-7d,待大量產(chǎn)孢后用滅菌水洗下孢子,采用血球計數(shù)法計數(shù),配成107個·mL-1的孢子懸浮液;取1mL孢子懸浮液加入裝有100mLPS培養(yǎng)液的250mL三角瓶中,在28℃、180r·min-1的搖床中培養(yǎng)5d,過濾去除菌絲體;用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液蒸餾濃縮為原體積的1/4,濃縮液用滅菌的濾膜(直徑0.22μm)過濾除菌,將無菌濾液與PSA培養(yǎng)基按1∶9的比例混勻后倒平板,每皿15mL;在平板中央接種培養(yǎng)4d的疫霉菌餅(直徑6mm),置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).對照:將無菌水與PSA培養(yǎng)基按1∶9的比例混勻后倒在平板上培養(yǎng)疫霉.在接種后24、48、72h分別測量疫霉菌的菌落直徑,計算抑菌率.抑菌率計算方法同1.3.2.1.4防治效果評價選擇生長一致、苗齡60d左右的煙苗,移栽于裝有滅菌土的花盆中(18cm×24cm),緩苗10d.煙草疫霉菌游動孢子懸浮液的制備參考鄭小波的方法,孢子含量為105個·mL-1.木霉菌孢子懸浮液的配制方法同1.3.3,孢子含量為107個·mL-1,盆栽防治試驗設(shè)以下3個處理.A:50mL木霉菌(TG050609)孢子懸浮液與50mL疫霉菌游動孢子懸浮液的混合液.B:50mL1mg·mL-1的甲霜靈錳鋅藥液與50mL疫霉菌游動孢子懸浮液的混合液.C(對照):50mL清水與50mL疫霉菌游動孢子懸浮液的混合液.用上述混合液灌根接種,方法同1.2.接種后于20℃下黑暗處理24h,然后在28℃、相對濕度為80%-90%的條件下進行室內(nèi)培養(yǎng),10d后觀察各處理煙苗的發(fā)病情況,計算發(fā)病率、病情指數(shù)及防治效果.每一處理15株煙苗,每個處理3次重復(fù).2結(jié)果與分析2.1莖內(nèi)染色病株13煙苗接種后第10天開始發(fā)病,首先根莖部位出現(xiàn)黑斑,并迅速向縱向和橫向環(huán)莖擴展,第13天黑斑環(huán)繞整個莖基部;病原菌侵染莖基部后很快向髓部擴展,縱剖病莖可見髓部呈黑褐色;病株葉片自下而上依次變黃,中下部葉片形成圓形褐色大病斑,萎蔫下垂;最終病株枯死,拔出病株可見根系變褐壞死;取病株進行分離,可分離到煙草疫霉菌(圖1).2.2木霉對草真菌病的抗性2.2.1煙草疫霉絲相關(guān)病原菌生長特性木霉與煙草疫霉對峙培養(yǎng)試驗結(jié)果表明,木霉菌對煙草疫霉有一定的抑制作用(表1),其中綠色木霉菌株TG050609對煙草疫霉生長的抑制作用顯著.該菌株生長快,能迅速占領(lǐng)營養(yǎng)空間,并能覆蓋煙草疫霉的菌落.對峙培養(yǎng)48h后,在木霉菌絲與煙草疫霉菌絲交接處挑取菌絲在顯微鏡下觀察,可以觀察到木霉菌絲纏繞于煙草疫霉菌絲上,產(chǎn)生吸器或類似吸器的結(jié)構(gòu)穿入疫霉菌絲,疫霉菌絲出現(xiàn)原生質(zhì)濃縮、菌絲斷裂和消解等現(xiàn)象.對峙培養(yǎng)中,菌落生長狀況表明病原菌生長受抑制,木霉菌能持續(xù)生長,并侵入疫霉菌落中,在疫霉菌落上生長蔓延;疫霉菌落最終萎縮消解,形成大量綠色孢子(圖2).2.2.2木霉菌對煙草疫霉的影響結(jié)果表明,木霉菌生長過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝物能抑制煙草疫霉的生長(表1).接種后72h的觀察結(jié)果表明,供試的4個木霉菌株中,綠色木霉TG050609產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝物對煙草疫霉生長抑制效果最大,抑制率達37.34%.挑取煙草疫霉菌絲進行顯微觀察,結(jié)果表明在木霉菌產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝物質(zhì)作用下煙草疫霉出現(xiàn)菌絲生長畸形、原生質(zhì)濃縮、菌絲縊縮斷裂和消解等現(xiàn)象(圖3).2.2.3木霉對煙草疫霉的生長抑制率結(jié)果表明,木霉菌發(fā)酵濾液能抑制煙草疫霉的生長.接種后72h的觀察結(jié)果表明,綠色木霉菌株TZ050610和TG050609發(fā)酵濾液對煙草疫霉菌的生長抑制率分別達到45.06%和43.03%(表1).從木霉發(fā)酵濾液培養(yǎng)基上挑取煙草疫霉菌絲進行鏡檢,可見菌絲扭曲畸形、中央縊縮斷裂、菌絲消解等現(xiàn)象(圖4).上述試驗結(jié)果表明,木霉對煙草疫霉生長具有抑制作用,不同木霉菌的抑制效果有差異.供試的4株木霉菌中以綠色木霉菌株TG050609對煙草疫霉的抑制效果最顯著.該菌株進一步用于煙草黑脛病盆栽防治試驗.2.3煙苗和煙苗抗菌防治盆栽接種試驗結(jié)果表明,用58%甲霜靈錳鋅WP防治煙草黑脛病,煙苗發(fā)病率為62.23%,病情指數(shù)為24.43,相對防效為42.10%.用木霉菌TG050609孢子懸浮液防治煙草黑脛病,煙苗發(fā)病率為53.30%,病情指數(shù)為18.33,相對防效為56.53%,略優(yōu)于58%甲霜靈錳鋅WP(表2).3煙草疫霉菌生防作用木霉菌對植物病原菌的防治主要是通過競爭作用、重寄生作用和抗生、溶菌作用,其在生長過程中產(chǎn)生的代謝物質(zhì)使病原菌菌絲細胞質(zhì)消解,菌絲斷裂、溶解,從而抑制病原菌的生長.結(jié)果表明,木霉菌TG050609對煙草疫霉菌具