枯草芽孢桿菌pb55菌株對煙草赤星病菌的抑菌機制

枯草芽孢桿菌pb55菌株對煙草赤星病菌的抑菌機制

由鏈格唑引起的虛假煙霧病是明末葉片重要疾病，在中國的各個地區(qū)都會發(fā)生，嚴重影響了葉片的產(chǎn)量和質(zhì)量。當前該病害的防治依賴化學(xué)藥劑,受環(huán)境因素影響大,防治效果不理想,易產(chǎn)生農(nóng)藥殘留。且主用藥劑菌核凈在煙草生產(chǎn)上連續(xù)使用多年,由于抗藥性產(chǎn)生,防治效果明顯下降。尋找新的替代藥劑或更好的途徑防治煙草赤星病極為重要。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)對多種植物病原菌具有生防作用,通過分泌溶菌酶、嗜鐵素、抗生素等代謝物,直接或間接促進植物生長,防治煙草赤星病有良好應(yīng)用潛力。但是,有關(guān)枯草芽孢桿菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抗真菌作用研究較少。Compant等報道枯草芽孢桿菌GBP3菌株對尖鐮孢(Fusariumoxysporum)引起的枯萎病具有拮抗作用。江木蘭等發(fā)現(xiàn),油菜內(nèi)生枯草芽孢桿菌BY-2菌株揮發(fā)性物質(zhì),能夠抑制油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)菌絲生長。Leelasuphakul等測定了205個枯草芽孢桿菌菌株的揮發(fā)物,對水果綠霉病菌(Penicilliumdigitatum)菌絲生長的抑制作用,其中有9個菌株的抑制率達80%以上。上述研究表明,枯草芽孢桿菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物與其非揮發(fā)性產(chǎn)物一樣,是一類重要的生防資源,但對其作用機制和生防途徑均未做深入研究。在本研究中,作者以煙草赤星病菌作為指示病原菌,系統(tǒng)研究了枯草芽孢桿菌Tpb55菌株揮發(fā)性代謝產(chǎn)物抑菌、防病及促生效應(yīng),對尋找煙草赤星病以及其他植物病害生物防治的新途徑和模式進行了有益探索。1材料和方法1.1tpb65菌株的制備煙草赤星病菌由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草所病理實驗室分離鑒定,PDA培養(yǎng)基斜面4℃下保存。使用前轉(zhuǎn)接到PDA平板上培養(yǎng)5～7d(26℃),用無菌水洗下,1500g離心3min去除菌絲,取上清液即為孢子懸浮液,稀釋至103個/ml,接種前制備最佳。Tpb55菌株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草所病理實驗室分離鑒定,NA培養(yǎng)基斜面4℃下保存,使用前轉(zhuǎn)接到NA平板上活化2次。煙草品種云煙85,托盤育苗,2～4片真葉時假植到育苗盆(φ10.0cm)消毒土中,備用。1.2揮發(fā)物對煙草赤星病菌生長的影響參照江木蘭等方法,將煙草赤星病菌菌塊(φ5.0mm)和Tpb55菌株分別接種在裝有PDA培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中預(yù)培養(yǎng)1d,以不接Tpb55的NA培養(yǎng)皿作對照,去掉培養(yǎng)皿蓋,將PDA培養(yǎng)皿倒扣在NA培養(yǎng)皿上,用封口膠將2皿交接處密封,26℃培養(yǎng)。當對照菌絲長滿平皿時,測定揮發(fā)物對煙草赤星病菌的作用。1.2.1Tpb55揮發(fā)物對赤星病菌菌絲生長的影響十字交叉法逐日測定對照和揮發(fā)物處理赤星病菌菌落直徑,計算抑制率。1.2.2Tpb55揮發(fā)物對赤星病菌菌落性狀及菌落色素形成的形態(tài)學(xué)觀察觀察Tpb55揮發(fā)物對菌絲生長、色素產(chǎn)生及孢子產(chǎn)生的影響。1.2.3Tpb55揮發(fā)物對赤星病菌分生孢子產(chǎn)生的影響將處理與對照赤星病菌的分生孢子用10.0ml無菌水洗下,用血球計數(shù)板分別測定其濃度,然后轉(zhuǎn)化成分生孢子總產(chǎn)量。1.3煙草赤星病菌tpb65菌株的分離培養(yǎng)選容積5L的干燥器,用硫酸調(diào)節(jié)其內(nèi)部濕度為85%。取4～5真葉期煙苗2盆,每盆2株,用接種噴霧器,接種煙草赤星病菌孢子。將活化好的Tpb55菌株接種到PDA平板上,28℃培養(yǎng)24h,去掉皿蓋與2盆煙苗一同置入干燥器中,培養(yǎng)皿置于底部,凡士林封口,28℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng),觀察記載煙株發(fā)病率和病斑數(shù)。以不接種Tpb55菌株為對照,每處理3次重復(fù)。1.4煙苗株高、地徑、細株鮮重測定方法同1.3。待煙苗長至20d后,小心將煙苗整株挖出,洗去根部泥土,測量其株高、最大葉的長寬、整株鮮重等指標。以不接種Tpb55菌株為對照,每處理3次重復(fù)。2結(jié)果2.1揮發(fā)性抗菌物質(zhì)培養(yǎng)抑菌測定結(jié)果(圖1)表明,Tpb55在NA培養(yǎng)基上產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)抑制病原真菌生長。與煙草赤星病菌共同培養(yǎng)1d即有揮發(fā)性抗菌物質(zhì)產(chǎn)生,對赤星病菌菌絲生長抑制率達70%以上。處理5d后,病原真菌僅僅向4周伸長3.0mm,而對照平板上真菌幾乎覆蓋整個培養(yǎng)皿,菌絲生長抑制率達95.0%。2.2赤星病菌病原菌形態(tài)觀察Tpb55菌株揮發(fā)物作用于煙草赤星病菌后,菌絲較稀疏,生長緩慢,黑色素形成受阻,菌落呈黃色(圖2A);挑菌落置顯微鏡下觀察,赤星病菌菌絲形態(tài)無明顯變化,較透明,但未見有分生孢子(圖2C)。對照赤星病菌菌絲則致密,生長旺盛,菌落呈灰褐色,菌絲稍暗,夾雜大量分生孢子(圖2B)。2.3分生孢子檢測結(jié)果Tpb55菌株揮發(fā)物作用于煙草赤星病菌5d后測定,所有平板均檢測不到赤星病菌分生孢子,而對照分生孢子產(chǎn)量平均達2.36×107個/皿。2.4煙苗病斑和病斑數(shù)調(diào)查接種赤星病菌后3d,對照煙株陸續(xù)開始發(fā)病;接種后5d,對照煙株全部發(fā)病,病斑主要集中在底部2～3片葉上;接種后10d調(diào)查,對照煙苗病株率為100%,病斑數(shù)達8.02個/株,發(fā)病葉片變黃枯死。Tpb55菌株揮發(fā)物處理煙株全部生長良好,葉色正常,未見有發(fā)病葉片。2.5tpb54植株的生長特性促生試驗結(jié)果(表)表明,Tpb55菌株揮發(fā)物對煙苗有較好的促生效果。與對照相比,Tpb55菌株揮發(fā)物處理煙苗在株高、最大葉長、葉寬、鮮重等指標上顯著增加,增加幅度分別為11.95%、18.49%、11.29%和12.35%。Tpb55菌株揮發(fā)物處理煙苗20d后,與對照煙苗植株相比,葉色濃綠,葉片肥厚且大,長勢更加旺盛。3揮發(fā)性抗菌物質(zhì)生物防治資源是可持續(xù)農(nóng)業(yè)研究與發(fā)展的重要前提,發(fā)展生物防治的新思想、新方法和新技術(shù),提高綜合防治水平,有利于環(huán)境保護、食品安全、生物多樣性。拮抗微生物是植物病害生物防治的重要因子。微生物產(chǎn)生拮抗物質(zhì)包括非揮發(fā)性物質(zhì)和揮發(fā)性物質(zhì),長期以來,大量植病生防研究集中于微生物產(chǎn)非揮發(fā)性物質(zhì)研究,純化、鑒定了多種抗菌物質(zhì),如細菌素(bacteriocins)、熒光素(fluorescein)、土壤桿菌素(agrocin)、酚類物質(zhì)、多肽類抗生素(polypeptides)、蛋白質(zhì)類抗真菌素等,并廣泛應(yīng)用于植物病害的生物防治。有關(guān)微生物揮發(fā)性代謝產(chǎn)物用于植病生防的研究報道較少。Vespermann等測定了9個細菌菌株揮發(fā)性代謝物對立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)菌絲生長的抑制作用,供試菌株均表現(xiàn)不同程度的拮抗作用,其中枯草芽孢桿菌B2等7個菌株具強烈抑制作用(80%～99%),證明了拮抗細菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對植物病原菌有明顯的影響。本研究結(jié)果表明,對煙草赤星病菌菌絲生長抑制率達95%以上,說明產(chǎn)揮發(fā)性抗菌物質(zhì)是Tpb55菌株重要抑菌機制之一。揮發(fā)性物質(zhì)的抗真菌作用主要有抑制孢子萌發(fā)或菌絲生長、孢子形成、子囊的產(chǎn)生和致畸作用。Tpb55菌株揮發(fā)物對赤星病菌抑制作用主要以抑制菌絲生長和分生孢子的產(chǎn)生,對防止病原菌的侵染和病害傳播具有重要意義。較非揮發(fā)性抗菌物質(zhì),揮發(fā)性抗菌物質(zhì)更易于在土壤或空氣中滲透和擴散,能更有效地殺滅病原菌接種體。Leelasuphakul等認為芽孢桿菌對倉儲水果的防治效果主要得益其揮發(fā)性抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生。為了探索微生物揮發(fā)物用于植病生防的途徑,本研究開展了封閉條件下,模擬病害環(huán)境,測定了Tpb55菌株揮發(fā)物對煙草赤星病的防治作用。結(jié)果表明,該菌株揮發(fā)物在試驗條件下,有效抑制了病害的發(fā)生,防治效果達100%。生防菌對寄主植物的影響是判斷其是否具有推廣應(yīng)用價值的重要依據(jù),此前研究結(jié)果表明,枯草芽孢桿菌揮發(fā)物對寄主植物(擬南芥)無不良影響,具促生作用。本文研究結(jié)果與上述研究一致,Tpb55菌株揮發(fā)物對煙草生長無明顯毒害作用,且在株高、鮮重等方面較對照顯著增加。大量研究表明,微生物中產(chǎn)揮發(fā)性抗菌物質(zhì)的菌株是重要的植病生防資源,具有良好的生防潛力和應(yīng)用前景,但長期以來相關(guān)領(lǐng)域研究卻受到忽視,生防潛力沒有得到充分的發(fā)掘。本研究為