大孔吸附樹脂分離純化連錢草總黃酮的研究

大孔吸附樹脂分離純化連錢草總黃酮的研究

連金草，又名金錢草、大冶金錢草、頭骨瘦。這是嘴唇科植物的血靈丹。glecc（nakai）kubar。土壤樣本于2005年，具有濕洗、清熱解毒、分散和囊腫的功能。在民間被廣泛應(yīng)用于治療尿路感染、感冒、跌打損傷、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腹瀉等。連錢草中的主成活性成分為黃酮類,有松樟酮(pinocamphone)、薄荷酮、異薄荷酮、番薄荷酮(pulegone)等。近年來對于連錢草有效成分的研究日益增多,但尚未見連錢草總黃酮分離純化的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在通過對大孔吸附樹脂分離純化連錢草總黃酮的工藝條件進(jìn)行系統(tǒng)的研究,為連錢草制劑的研制、開發(fā)和生產(chǎn)奠定一定的基礎(chǔ)。一、藥品、試劑和試劑分光光度計(jì)[Agilent1100,美國安捷倫(Agilent)科技公司],樹脂(安徽三星樹脂科技有限公司);蘆丁對照品(由中國生物制品檢定所提供);連錢草(廣東云浮市康達(dá)醫(yī)藥公司提供);亞硝酸鈉(上海綠源精細(xì)化工廠,分析純)和氫氧化鈉(青島世紀(jì)星化學(xué)試劑有限公司,分析純);超聲波清洗儀(深圳市科工達(dá)超聲設(shè)備有限公司)。二、實(shí)驗(yàn)方法1線性關(guān)系的測定采用紫外分光光度計(jì)法對連錢草總黃酮進(jìn)行測定。(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取120℃常壓干燥至恒重的蘆丁對照品20.56mg,置于100ml的容量瓶中,加60%乙醇約60ml,密塞,超聲使其溶解,放冷,加60%乙醇至刻度,搖勻,得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.2056mg/m1)。精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml,分別置于25ml的容量瓶中,分別加水6、5、4、3、2、1、0ml,加5%亞硝酸鈉溶液1ml,搖勻,放6min,加三氯化鋁試液1ml。搖勻,放置6min,再加5%的氧化鈉溶液10ml,加水至刻度,搖勻,以第一管作空白對在510nm處測吸光度。繪制濃度-吸光度曲線,求出回歸程為y=0.0963A-0.00014,r=0.9991,式中Y代表照品濃度(mg/m1),A代表吸光度,對照品在0～0.0493mg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。(2)上柱液的制備和連錢草總黃酮含量測定參考文獻(xiàn)選用乙醇做溶劑,采用超聲提取法做為樣品制備的方法。取連錢草粉末約0.5g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加60%乙醇60ml,密塞,稱定重量,超聲50min。放冷,密塞,再稱定重量,用60%乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,過濾,得續(xù)濾液,即上柱液。濃縮液加入適量水,離心過濾后得澄清連錢草提取物上柱液。精密量取供試品溶液3.0ml,然后按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下方法測定總黃酮的含量。2靜態(tài)吸附法測定8種樹脂靜態(tài)吸附量、吸附率和解吸率,以篩選樹脂。在帶塞的錐形瓶中,加入一定量預(yù)處理好的大孔吸附樹脂和浸出液于室溫下振蕩,每隔1h測定吸附前后連錢草總黃酮濃度的變化,計(jì)算各樹脂的靜態(tài)吸附容量和吸附率,然后加入60%乙醇水溶液進(jìn)行洗脫,測定脫附液中連錢草總黃酮的含量,計(jì)算脫附率。3連錢草總黃酮的吸附動(dòng)力學(xué)研究取1g樹脂加入40mL1.4mg.mL-1的連錢草總黃酮溶液,在不同時(shí)刻取少量溶液分析連錢草總黃酮濃度,繪制吸附動(dòng)力學(xué)曲線。同時(shí)取1g樹脂加入40mL一系列濃度的連錢草總黃酮溶液,進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)。測定吸附前后的溶液濃度,計(jì)算樹脂吸附量,得到等溫吸附曲線。4洗脫劑和清洗條件的選擇對已經(jīng)吸附樣品的樹脂進(jìn)行脫附實(shí)驗(yàn),作出脫附曲線。考察脫附劑的種類、濃度、流速等因素對樹脂脫附性能的影響,確定最佳的脫附工藝。三、結(jié)果1吸附及脫附試驗(yàn)在相同試驗(yàn)條件下,測得各樹脂的靜態(tài)吸附及脫附結(jié)果見表1。由表中可以看出D-101型樹脂的吸附率和脫附率較高,因此選擇D-101型樹脂做為研究對象。2連錢草總黃酮的吸附動(dòng)力學(xué)關(guān)系取1g樹脂加入40mL1.4mg.mL-1的連錢草總黃酮溶液,在不同時(shí)刻取少量溶液分析連錢草總黃酮濃度,以時(shí)間為橫坐標(biāo),吸附量為縱坐標(biāo),繪制吸附動(dòng)力學(xué)曲線,見圖1。從圖1可見,D-101樹脂在起始階段吸附速率較大,80min開始,吸附量增加緩慢。3吸附等溫線研究分別配制不同濃度的連錢草總黃酮上柱液,稱取一定量的D-101樹脂在常溫下作吸附等溫線,見圖2。由圖2可知,隨著溶液中連錢草總黃酮濃度的增加,樹脂的吸附量首先增加很快,但當(dāng)濃度達(dá)1.4mg.mL-1后,增長緩慢。4連錢草總黃酮的洗脫效果實(shí)驗(yàn)表明,采用甲醇-水、乙醇-水等體系對連錢草總黃酮均有較好的洗脫效果?？紤]到甲醇的成本與安全性等因素,以及實(shí)際工作中的安全、成本等問題,確定以乙醇-水體系作為洗脫劑。5洗脫率及洗脫率將已吸附好樣品的樹脂用一系列不同濃度的乙醇-水進(jìn)行洗脫,測洗脫液濃度,計(jì)算洗脫率。結(jié)果見表2。60%乙醇洗脫率就比較高,而洗脫劑濃度的增加后,脂溶性雜質(zhì)也會(huì)增多,故選擇60%的乙醇-水作為洗脫劑。6在最佳分離條件下，洗脫曲線在常溫下,用60%的乙醇-水為脫附劑,以0.5mL.min-1的速度對已吸附了樣品的樹脂進(jìn)行洗脫,洗脫曲線見圖3。7連續(xù)使用的穩(wěn)定性考察了樹脂的再生性能,經(jīng)果見表3,D-101樹脂在連續(xù)使用6次后吸附率下降比較明顯,因而應(yīng)該每使用4次進(jìn)行1次再生。D-101樹脂的再生是用無水乙醇冼脫,然后用蒸餾水洗至中性。四、有機(jī)污染物分離大孔吸附樹脂(macroporou$absorptionresin)是由聚合單體和交聯(lián)劑、致孔劑、分散劑等添加劑經(jīng)聚合反應(yīng)表3D-101樹脂使用次數(shù)對吸附率的影響制備而成的一類有機(jī)高聚物吸附劑。從吸附性能來說,它具有理化性質(zhì)穩(wěn)定,不溶于酸、堿及有機(jī)溶劑,選擇性較好,不受無機(jī)物影響眾多優(yōu)點(diǎn)。大孔吸附樹脂可以通過物理吸附從流動(dòng)相中把有機(jī)物按吸附能力的不同和分子量大小的差異有選擇地進(jìn)行吸附,基于大孔吸附樹脂吸附性和篩選性相結(jié)合的原理,再根據(jù)“相似相溶”原理,選擇合適的洗脫劑即可將有機(jī)物進(jìn)行分離純化。今年來利用大孔吸附樹脂對黃酮類成分進(jìn)行分離和純化的研究已日益成熟。通過實(shí)驗(yàn)證明采用大孔吸附樹脂分離連錢草提取液中總黃酮是可行的。D-101樹脂是良好的吸附樹脂,對連