轉基因煙草幼苗生理高溫抗熱性研究

轉基因煙草幼苗生理高溫抗熱性研究

根據(jù)氣候預測，溫室效應促進了全球氣溫的上升，所有植物都面臨著高溫和其他挑戰(zhàn)，植物的抗熱性變得越來越重要。在高溫脅迫下,植物的器官、組織、細胞、以及細胞內的細胞器結構會發(fā)生改變,植株的生理生化過程會受到影響,從而不同程度地影響植物的生長發(fā)育。MARTIREAU等指出植物在高溫脅迫下的膜傷害與質膜透性的增加是高溫傷害的本質之一。由于高溫下細胞內的超氧自由基(O-2)、羥自由基(OH-),MDA的產生和消除的平衡受到破壞,而造成O-2,OH-和MDA的積累,引起膜中蛋白質聚合和交聯(lián)以及膜中脂類的變化,從而直接影響膜的流動性和透性,對植物造成傷害。吳國榮等用生理高溫處理佛州側耳時,發(fā)現(xiàn)佛州側耳呼吸速率增大,吸收O2的速率增加,產生O-2的速率隨之同步增加,SOD活性就逐步升高。生理高溫是指介于植物生長的最適溫度與最高溫度之間的高溫。持續(xù)的生理高溫會不同程度地影響生物的生長發(fā)育和新陳代謝。煙草(NicotianatobacumL.)起源于熱帶,是一種很重要的經濟作物。煙草屬于喜溫作物,其一般生長適宜溫度為25～28℃,如遇較長時間高溫脅迫下,其生長發(fā)育會受到不同程度的影響,特別在幼苗生長時期,受到的影響最為明顯。提高植物耐熱性的方法有多種,其中有效途徑之一是培育轉基因耐熱植物。例如,通過轉基因方法,提高植物抗氧化酶(如SOD,CAT)活性,能夠有效清除積累的活性氧類物質,從而可能提高植物的抗熱性。鑒定植物的耐熱性指標有很多種,如形態(tài)指標、生長指標、生理生化指標、分子生物學指標等。胡志輝等用種子活力測定、外觀形態(tài)觀察、夏季田間自然鑒定、電導率、葉綠素測定等方法評價辣椒新品種的耐熱性。本文以兩個轉基因煙草品系和一個非轉基因品系作為試驗材料,用生理高溫(38±1)℃處理供試煙草品系幼苗,通過觀察和測定有關形態(tài)、生理生化指標及生物量,初步評價轉基因煙草的抗熱性。1材料和方法1.1煙草品系的表達轉基因Mn-SOD高表達煙草品系(簡稱Mn-SOD高)、轉基因POD高表達煙草品系(簡稱POD高)和非轉基因煙草對照品系(簡稱非轉基因)。1.2生理生化指標選生長基本一致的盆栽7～8葉齡的煙苗,每個品系30株,分為處理組和對照組。各設5次重復。將處理組幼苗置于恒溫箱中,每天10∶00～17∶00控溫為(38±1)℃,其余時間讓其在自然溫度下生長。對照組煙苗在自然條件下生長。分別在高溫處理3d(T3)和6d(T6),以及高溫處理3d后恢復生長4d(T3-H4)、高溫處理6d后恢復生長4d(T6-H4)和高溫處理6d后恢復生長8d(T6-H8),取樣測定相關生理生化指標。用處理/對照的百分比表示生理高溫對供試品系的影響。1.3材料的恢復生長待高溫處理3d的材料恢復生長10d(H3-10),高溫處理6d的材料恢復生長10d(T6-H10)及高溫處理6d的材料恢復生長20d(T6-H20)后,將煙苗連根拔起,洗凈泥沙,自然晾干,稱重。用處理/對照的百分比表示生理高溫對供試品系的影響。1.4電導率的測定用NBT光化還原法測定SOD活性。用考馬斯亮藍法測定蛋白質的含量。用硫代巴比妥酸法測定丙二醛和可溶性糖含量。質膜透性的測定:用打孔器取10個煙葉小圓片(避開大葉脈)于20mL刻度試管中,加入超純水至刻度處,然后置于真空干燥器中用真空泵分兩次共抽氣60min,使葉圓片沉于水中。取出搖勻,用電導儀測定其電導率;然后置于沸水中煮15min,自然冷卻后加超純水至刻度,搖勻后測定電導率。用相對電導率(第1次電導率值/第2次電導率值×100%)表示細胞質膜透性的大小。2結果與分析2.1高溫處理對煙苗激發(fā)葉片的影響生理高溫對煙苗葉片都產生了不同程度的傷害。高溫處理3d的煙苗基部少數(shù)葉片表現(xiàn)出一定程度的萎蔫,傷害較輕。高溫處理6d的煙苗基部多數(shù)葉片表現(xiàn)出明顯萎蔫,部分葉片由綠色變?yōu)闇\黃色、黃色,甚至有一部分葉片脫落。由此看出,所用生理高溫(38±1)℃對煙苗生長有脅迫作用,而且高溫處理的時間越長,脅迫作用越明顯。2.2在煙苗生理高溫處理后生長情況據(jù)圖1可知,生理高溫處理時間越長,煙苗生長受到的傷害越大,恢復正常生長需要的時間越長。例如,POD高T3-H10為97.47%,T6-H10為72.73%。由此可見,與生理高溫處理6d的煙苗相比,生理高溫處理3d的煙苗更容易恢復正常生長。比較生理高溫處理后的煙苗恢復生長情況,發(fā)現(xiàn)3個供試煙草品系恢復生長的速度由大到小排列為:POD高>Mn-SOD高>非轉基因。例如,POD高T6-H10為72.73%,Mn-SOD高T6-H10為65.93%,非轉基因T6-H10為56.69%。這表明生理高溫對轉基因煙草品系幼苗影響相對較小,其中POD高品系幼苗受到的影響最小。2.3煙苗的質膜透性生理高溫處理期間的煙草幼苗,其細胞質膜透性(相對電導率)均降低。處理6d后的煙苗,在恢復生長初期,其質膜透性均升高;隨恢復生長時間延長,質膜透性均降低。這表明生理高溫對煙苗細胞的傷害是一種漸變的量變過程。生理高溫處理6d,恢復生長4d的煙苗質膜透性,非轉基因升高34.42%,Mn-SOD高升高23.21%,POD高升高17.08%(圖2)。由此可見,轉基因煙草品系幼苗的耐熱性比非轉基因品系強。2.4煙草品系葉片mda含量的變化生理高溫處理可引起煙草幼苗葉片丙二醛(MDA)的含量升高。生理高溫處理的時間越長,供試煙草品系葉片的丙二醛(MDA)的含量越高。例如,非轉基因品系的MDA含量,T3升高21.1%,T6升高70.84%。在恢復生長期間,各供試品系煙苗葉片的MDA含量都下降。生理高溫處理第6d,3個煙草品系幼苗葉片MDA含量的升高值由大到小依次是:非轉基因>Mn-SOD高>POD高(圖3)。這說明轉基因煙草品系幼苗的耐熱性比非轉基因品系更強。2.5葉片可溶性糖含量從圖4可以看到,生理高溫處理引起煙草幼苗葉片可溶性糖含量升高。處理時間越長,葉片可溶性糖含量越高,其中非轉基因品系上升最快,SOD高品系其次,POD高品系上升最慢?；謴蜕L期間,3個品系的可溶性糖含量都下降,隨著恢復生長時間的延長,可溶性糖含量可能恢復到正常水平。2.6煙草幼苗葉片sod活性的變化生理高溫處理引起轉基因煙草幼苗葉片SOD活性升高,高溫處理的時間越長,轉基因煙草幼苗葉片SOD活性越高,而非轉基因煙草幼苗葉片SOD活性沒有明顯變化(圖5)。由于SOD是一種有效的抗氧化酶,因此,SOD活性的增加可增強植物的逆境耐性。由此認為,轉基因煙草幼苗比非轉基因煙草更能適應生理高溫環(huán)境。3生理高溫對煙草幼苗抗氧化酶系統(tǒng)的影響植物在逆境下,通過代謝反應來阻止、降低或修復由逆境造成的損傷,從而保持正常的生理活動。在植物可忍耐的范圍內,逆境所造成的傷害是可逆的,即植物可以恢復正常狀態(tài);如果超過可忍耐的范圍,超出植物自身修復能力,損傷將變成不可逆的,植物將受害甚至死亡。生理高溫對植物造成的傷害是可逆的。在生理高溫脅迫下,植物的呼吸速率增大,消耗的有機物增多,積累的物質減少,植物生長緩慢,單株重減輕。耐熱性強的植物則受影響較小。在生理高溫脅迫下,植物細胞內的可溶性糖含量增加,為呼吸速率的提高提供物質和能量條件。植物細胞內的可溶性糖含量越高,細胞的呼吸代謝越旺盛。呼吸代謝產生的對細胞有害中間產物(如O-2,OH-等活性氧類)增加,這些產物的積累會損傷細胞,甚至使細胞死亡?；钚匝躅悅χ参锛毎闹匾C據(jù)之一,是它們使細胞膜脂過氧化。MDA是植物細胞膜脂過氧化的終產物,其含量越高說明植物細胞受到的傷害越大。與耐熱性弱的植物相比,在生理高溫脅迫下,耐熱性強的植物細胞MDA含量較低。植物細胞膜脂過氧化的結果是細胞膜的通透性增大,細胞外滲的物質增加,對細胞的正常生活造成傷害。耐熱性強的植物在生理高溫下,細胞受到的傷害較小,細胞膜的透性較低。在生理高溫脅迫下,細胞內的SOD(一種重要的抗氧化酶)能夠專一清除細胞有氧代謝產生的過多的活性氧類(O-2),減輕或避免活性氧類對植物細胞的傷害。在生理高溫脅迫下,耐熱性強的植物細胞內的SOD活性更高。本試驗發(fā)現(xiàn),轉基因煙草幼苗受生理高溫處理時,其SOD活性明顯升高,MDA和可溶性糖含量升高較小。生理高溫對供試煙苗品系細胞質膜的傷害可能是一種漸變的量變過程。經生理高溫處理3d和6d,煙苗細胞質膜均未明顯表現(xiàn)受傷害現(xiàn)象。在恢復生長期間,生理高溫處理后的煙苗細胞質膜才表現(xiàn)出受害癥狀。與非轉基因煙草相比,轉基因煙草幼苗細胞質膜