木霉菌株ri2發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲病的田間防治效果

木霉菌株ri2發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲病的田間防治效果

0木霉菌防治根結(jié)線蟲的研究進(jìn)展根結(jié)線蟲（meloidold.）的采樣能力超過3000種。這是設(shè)施農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見的人為障礙和災(zāi)難之一。根結(jié)線蟲對作物的產(chǎn)量損失一般為20%左右,嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)30%~40%,甚至絕收。由于栽培黃瓜中未發(fā)現(xiàn)抗南方根結(jié)線蟲的種質(zhì)資源,在生產(chǎn)中化學(xué)防治仍然是防治根結(jié)線蟲的重要措施,但是大量且重復(fù)性使用化學(xué)殺線劑會嚴(yán)重污染環(huán)境,威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及人類的安全,因此生物防治日益受到人們的重視?，F(xiàn)在,國內(nèi)外都有一些商品化的生防制劑用于防治根結(jié)線蟲。木霉菌(Trichodermaspp.)屬于半知菌門絲孢目木霉屬,廣泛存在于不同環(huán)境條件下的土壤中,是非常有用的絲狀真菌,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。常見的木霉有綠色木霉、康寧木霉、棘孢木霉、深綠木霉、哈茨木霉、長枝木霉等。在大約80年前,人們就發(fā)現(xiàn)木霉菌具有控制植物病害的作用,可產(chǎn)生多種對植物病原真菌、細(xì)菌及昆蟲具有拮抗作用的生物活性物質(zhì),比如細(xì)胞壁降解酶類和次級代謝產(chǎn)物,并能提高農(nóng)作物的抗逆性、促進(jìn)植物生長和提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量,因此被廣泛用于生物防治。木霉菌是防治植物寄生性線蟲的生防資源,國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道證實(shí),木霉菌可以寄生根結(jié)線蟲的卵,發(fā)酵液可以殺死根結(jié)線蟲二齡幼蟲(J2),減少根結(jié)數(shù)量。但是應(yīng)用木霉菌防治根結(jié)線蟲的研究仍然很少,為了進(jìn)一步挖掘木霉菌防治根結(jié)線蟲的資源,特別是哈茨木霉菌資源,筆者從土壤中分離并篩選了木霉菌株TRI2,進(jìn)行了種類鑒定。采用TRI2發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲J2進(jìn)行致死效應(yīng)分析,并以黃瓜為供試作物,在溫室盆栽及大田中進(jìn)一步確定了菌株TRI2對黃瓜根結(jié)線蟲的防治效果,為開發(fā)新型、高效的木霉菌殺線劑及合理應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1土壤的利用黃瓜(CucumissativusL.)‘9930’種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所黃瓜課題組提供,用于盆栽試驗(yàn)及田間試驗(yàn)。木霉菌TRI2采用稀釋分離法分離自北京順義溫室菜田土壤,由本所病害實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行單孢純化用于試驗(yàn)。南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)采自北京海淀區(qū)四季青農(nóng)場,并在溫室中在感病的‘茄門’辣椒(Capsicumannuum)上進(jìn)行單卵塊繁殖,將辣椒根系取出,用水輕輕沖洗,取下卵塊,置于1%的次氯酸鈉中消毒3min,再用無菌水沖洗3次,放入內(nèi)有少量無菌水的培養(yǎng)皿中,25℃恒溫孵化,每隔24h收集一次J2,收集的線蟲用于室內(nèi)殺線蟲試驗(yàn)及溫室盆栽接種試驗(yàn)。根結(jié)線蟲田間防效試驗(yàn)于2013年8—11月在河北昌黎蔬菜生產(chǎn)基地進(jìn)行,化學(xué)藥劑1.8%的阿維菌素購于市場。1.2來自特記住特記住昆蟲2的疾病1.2.1形態(tài)鑒定方法將木霉菌株進(jìn)行單孢分離后,接種到PDA培養(yǎng)基上觀察菌落顏色、形態(tài)及培養(yǎng)性狀,挑取菌絲,在顯微鏡下觀察菌絲及孢子特征,根據(jù)培養(yǎng)性狀按照Rifai和Bissett的分類方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。1.2.2pcr擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測將單孢純化的木霉菌株TRI2,采用PDA液體培養(yǎng)基進(jìn)行震蕩培養(yǎng)5天(28℃,180r/min),收集菌絲及孢子,采用CTAB方法提取DNA,以DNA為模板,用引物ITS1、ITS4和EF1H、EF2T分別進(jìn)行ITS和tef1序列擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增程序分別為:95℃4min,1個(gè)循環(huán);95℃30s;55℃30s;72℃50s,35個(gè)循環(huán),72℃延伸10min,10℃保存1h。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將DNA片段進(jìn)行切膠回收,進(jìn)行測序(三博遠(yuǎn)志公司),并將序列提交NCBI(),進(jìn)行BLAST序列比對,在分子水平鑒定菌株的種類。1.3木霉tri2對黃瓜根結(jié)線蟲的預(yù)防1.3.1接種根結(jié)線蟲及接種苗子培養(yǎng)當(dāng)黃瓜第1片真葉完全展開時(shí)接種南方根結(jié)線蟲。接種時(shí)在距離黃瓜根2cm處的基質(zhì)中均勻打3個(gè)1cm深的小孔,注入線蟲懸浮液,每株接種根結(jié)線蟲600條,每個(gè)處理接種苗子10株,處理重復(fù)3次,并且以清水模擬接種為對照,盆栽試驗(yàn)重復(fù)3次。接種后苗子在溫室中進(jìn)行正常管理,在接種根結(jié)線蟲45天時(shí),觀察根部癥狀,檢測根結(jié),統(tǒng)計(jì)根結(jié)數(shù)量,計(jì)算根結(jié)減退率[式(2)],并用SAS9.1采用t測驗(yàn)對結(jié)果進(jìn)行方差分析。2結(jié)果與分析2.1分生孢子組織形態(tài)觀察菌株生長迅速,在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)2天,菌落長滿直徑5cm的培養(yǎng)皿,菌落圓形,菌絲白色,氣生菌絲較繁茂且呈現(xiàn)為棉絮狀,邊緣氣生菌絲較少,在5~7天菌落漸變?yōu)榫G色,最后變?yōu)榘稻G色,產(chǎn)生大量的綠色分生孢子,但菌落中仍然具有氣生菌絲,菌落背面變?yōu)樯铧S色(圖1F)。菌落氣味不明顯。在顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),菌絲透明,有隔,初級分枝有規(guī)律地間隔,與主枝常近直角略向上彎曲通常成對或3個(gè)輪狀排列(圖1A),分生孢子梗多對生或輪生,呈塔狀結(jié)構(gòu)(圖1B)。分生孢子梗呈瓶狀,長約20μm多數(shù)以2或3~5個(gè)輪狀排列(圖1A),分生孢子近球形至倒卵形,(2.5~3.3)μm×(2.3~3.0)μm,孢子壁光滑,淺綠色(圖1C)。菌株TRI2的培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征與哈茨木霉Trichodermaharzianum基本一致。2.2整株鑒定—木霉菌菌株TRI2的分子生物學(xué)鑒定以菌株TRI2的DNA為模板,用引物ITS1、ITS4和EF1H、EF2T分別擴(kuò)增獲得ITS和tef1片段(圖2),長度分別為574、880bp。將測定序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blast同源性搜索,發(fā)現(xiàn)ITS片段與Hypocrealixii菌株(Trichodermaharzianum有性世代)ITS序列JX088246.1相似性達(dá)到100%,tef1片段與Hypocrealixii菌株的tef1a序列AY605732.1、AY605770.1的相似性達(dá)到98%,結(jié)合TRI2培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征,將TRI2鑒定為哈茨木霉Trichodermaharzianum。2.3木霉tri2對黃瓜根結(jié)線蟲的預(yù)防2.3.1線蟲活性和抗菌材料活性檢測發(fā)酵液處理根結(jié)線蟲后,在12h內(nèi)線蟲幾乎沒有變化,隨時(shí)間延長發(fā)酵液對線蟲的校正死亡率明顯增加,在36h時(shí)發(fā)酵液對根結(jié)線蟲擊倒率接近100%,線蟲體呈現(xiàn)為略有弧度的僵直狀,但是將線蟲轉(zhuǎn)移到2%鹽水中,在體視顯微鏡下用竹針輕輕撥動(dòng),大約有15%~35%的線蟲能夠恢復(fù)活性,呈現(xiàn)為緩慢的蠕動(dòng)。在48h內(nèi)線蟲的校正死亡率達(dá)到100%(圖3),此時(shí)只有極少數(shù)的線蟲可以恢復(fù)活性(圖4B),在60h時(shí)所有線蟲全部死亡,不能恢復(fù)活性(圖4C)。對照在60h內(nèi)死亡率沒有顯著變化(圖4A)。2.3.2根結(jié)數(shù)量的顯著性t測驗(yàn)在接種南方根結(jié)線蟲45天后,調(diào)查根結(jié)情況,發(fā)現(xiàn)在木霉菌TRI2處理中根結(jié)小而少(圖5TRI2),3次試驗(yàn)中根結(jié)數(shù)量為83.9、93.1、76.0個(gè)/株,平均為85.3個(gè)/株,而在清水對照中根結(jié)數(shù)量多且根結(jié)大(圖5CK),3次試驗(yàn)中根結(jié)數(shù)量分別達(dá)到了243.3、229.7、227.1個(gè)/株,平均為233.4個(gè)/株。采用SAS9.1軟件對處理與對照的根結(jié)數(shù)量進(jìn)行方差顯著性t測驗(yàn)分析,證實(shí)標(biāo)準(zhǔn)差為33320.8,F值為448.24,Pr>F值(P<0.0001),說明處理與對照植株上的根結(jié)數(shù)量存在著極顯著差異(圖6)。按根結(jié)減退率公式計(jì)算,TRI2對黃瓜根結(jié)減退率達(dá)到63.5%,結(jié)果表明菌株TRI2對黃瓜南方根結(jié)線蟲具有一定的防治效果。2.3.3阿維菌素對黃瓜根系生長情況的影響在溫室大棚中,在黃瓜植株處理60天后,將黃瓜根系挖出,輕輕抖掉根際土壤,根據(jù)病情級別標(biāo)準(zhǔn)確定根結(jié)線蟲發(fā)病情況。其中,對照黃瓜根結(jié)癥狀明顯,根結(jié)數(shù)量特別多,根結(jié)覆蓋面積所占全根系達(dá)到76%~100%,81%的植株病情級別達(dá)到了4級(圖7A),通過根結(jié)指數(shù)計(jì)算公式,3次試驗(yàn)中,對照的平均根結(jié)指數(shù)分別達(dá)到了93.18、97.73和95.45。在木霉菌處理中,黃瓜根系上只有少量根結(jié),且根結(jié)小,根結(jié)覆蓋面占全根系1%~25%(圖7B),90%的植株病情級別小于等于1,平均病情級別為1.07,3次試驗(yàn)中,木霉菌的平均根結(jié)指數(shù)分別達(dá)到了27.27、27.27和25.00。而在阿維菌素處理中,黃瓜根系上根結(jié)少且小,根結(jié)覆蓋面小于25%(圖7C),76%的植株病情級別小于等于1,平均病情級別為1.15,3次試驗(yàn)中根結(jié)指數(shù)達(dá)到34.09、22.73和29.55。通過防效公式計(jì)算,木霉菌的防治效果分別達(dá)到了71.4%、71.4%、73.8%,平均為72.2%(圖8);而阿維菌素的防治效果分別達(dá)到了64.3%、76.2%、69.0%,平均為69.9%(圖8)。采用SAS9.1軟件對3次試驗(yàn)的防治效果進(jìn)行方差分析,證實(shí)標(biāo)準(zhǔn)方差為8.16,F值為0.43,Pr>F的值為0.5467(P>0.05),方差分析說明雖然木霉菌TRI2的防治效果略高于阿維菌素,但是2個(gè)處理在防治效果上沒有顯著差別。TRI2的田間試驗(yàn)效果再次說明木霉菌TRI2對根結(jié)線蟲具有較好的防治效果。3哈茨木霉菌株對根結(jié)線蟲的防治效果本研究通過形態(tài)學(xué)觀察,并結(jié)合分子生物學(xué)ITS、tef1序列分析方法鑒定了哈茨木霉菌株,這在木霉菌株的鑒定方面有很高的準(zhǔn)確度。另外從室內(nèi)發(fā)酵液、溫室盆栽和田間試驗(yàn)3個(gè)方面逐步深入研究了哈茨木霉菌株TRI2對根結(jié)線蟲的防治效果,在室內(nèi)哈茨木霉菌株TRI2的發(fā)酵液殺死J2的效果很明顯,在溫室盆栽和田間試驗(yàn)中取得了較好的防治效果,這為生產(chǎn)上木霉生物制劑的開發(fā)和利用奠定了一定的基礎(chǔ)。研究結(jié)果對進(jìn)一步的研究哈茨木霉菌株TRI2與根結(jié)線蟲的互作機(jī)制以及該菌株產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物提供了依據(jù)。4木霉菌對根結(jié)線蟲的防治效果木霉菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用,它們可以產(chǎn)生大量的水解酶,木霉菌中分離到的相關(guān)酶的基因已經(jīng)用于改善作物對病原物的抗性。木霉菌可以產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物,對植物病原具有防控作用,同時(shí)還可以對作物(黃瓜)產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性。木霉菌可以增加植物的基本免疫反應(yīng)(PTI)和效應(yīng)子引發(fā)的免疫反應(yīng)(ETI),同時(shí),木霉菌可以促進(jìn)作物的生長。木霉菌作為一種典型的生防制劑已經(jīng)在世界范圍60多個(gè)國家廣泛應(yīng)用,主要應(yīng)用于蔬菜、觀賞作物及大田作物。一些木霉菌的商品及制劑已經(jīng)在歐洲及南美洲應(yīng)用,但是由于木霉菌的遺傳多樣性,其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有充分利用。木霉菌用于線蟲病害生物防治方面的研究在國內(nèi)外的報(bào)道都較少,特別是防治根結(jié)線蟲的研究。但是很早就發(fā)現(xiàn)哈茨木霉可以產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶從而抑制根結(jié)線蟲卵的孵化,而且有些木霉菌對根結(jié)線蟲具有較高的防治效果。在國內(nèi)已經(jīng)報(bào)道分離到許多對根結(jié)線蟲具有防治效果的生防菌菌株,并且研究了哈茨木霉菌菌株Snef85及綠色木霉對根結(jié)線蟲的具有很高的致死作用,長枝木霉防治南方根結(jié)線蟲的致死效應(yīng)及寄生作用亦得到證實(shí),應(yīng)用木霉菌防治根結(jié)線蟲日益受到人們的重視。通過研究,筆者分離到了哈茨木霉菌TRI2,并通過室內(nèi)生測、溫室盆栽及田間試驗(yàn)等確定了其對根結(jié)線蟲具有較好的防治效果,這些研究結(jié)果與國內(nèi)外的研究結(jié)果相似,特別是在田間試驗(yàn)中,TRI2表現(xiàn)出較高的防效,這將為進(jìn)一步深入研究TRI2菌株及菌劑的商品化奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。另外,木霉菌TRI2處理后對黃瓜株高、產(chǎn)量及土壤中根結(jié)線蟲的影響仍然需要進(jìn)一步深入研究。雖然,一些木霉菌可顯著提高植物的生活力,延長結(jié)實(shí)期,但關(guān)于木霉防治根結(jié)線蟲的作用機(jī)制尚不清楚,原因可能是多方面的。木霉菌的生防機(jī)制涉及拮抗作用、競爭作用、重寄生作用、誘導(dǎo)植物抗性、促生作用等多個(gè)方面?，F(xiàn)在木霉菌的3個(gè)種T.reesei、T.atroviride、T.virens已經(jīng)完成了全基因的測序工作,這將為深入研究木霉菌對根結(jié)線蟲的作用機(jī)制提供重要平臺。通過試驗(yàn)筆者發(fā)現(xiàn)TRI2的發(fā)酵液對根結(jié)線蟲具有致死作用,說明菌株在代謝過程中產(chǎn)生了能夠殺死線蟲的物質(zhì),而在盆栽試驗(yàn)及田間試驗(yàn)中仍然具有較高的防治效果,說明TRI2菌株很可能存在著誘導(dǎo)植物抗性、重寄生作用等。因此TRI2對根結(jié)線蟲的作用機(jī)制、產(chǎn)生的殺線蟲代謝活性物質(zhì)的分離純化、高效菌劑的研制及改良等問題均有待于進(jìn)一步研究。將菌株TRI2接種于查氏培養(yǎng)基(NaNO32.0g、K2HPO41.0g、KCl0.5g、MgSO4·7H2O0.5g、FeSO40.01g、蔗糖30.0g、蒸餾水1000mL),于25℃液體搖瓶發(fā)酵7天。發(fā)酵液抽濾出菌絲,并通過12000r/min離心15min除去孢子后,將發(fā)酵液用于室內(nèi)殺線蟲試驗(yàn)。將200μL發(fā)酵原液分別加入到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,并且每孔加入200條J2,以清水作為對照,重復(fù)3次試驗(yàn)。分別在2、12、24、36、48、60h觀察線蟲死亡情況,將蟲體僵直的J2再次分離后置于盛有2%鹽水的培養(yǎng)皿中,在體視顯微鏡下用竹針輕輕撥動(dòng)J2,靜止不動(dòng)的即為死亡個(gè)體。根據(jù)式(1)計(jì)算線蟲的校正死亡率。1.3.2黃瓜種子培養(yǎng)將菌株TRI2接種于查氏培養(yǎng)基,25液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)大約7~10天,當(dāng)木霉菌孢子濃度達(dá)到2×107個(gè)/mL時(shí),將滅菌基質(zhì)(草炭:蛭石=2:1,V/V)與發(fā)酵液進(jìn)行充分混合作為培養(yǎng)介質(zhì)用于溫室盆栽接種試驗(yàn),發(fā)酵液接入量為每千克基質(zhì)加入100mL菌液。將黃瓜‘9930’種子用5%的NaClO消毒10min,用無菌水清洗干凈后28℃催芽1天,播種于72孔穴盤中,在25~28℃溫室中培養(yǎng)。當(dāng)黃瓜苗達(dá)到2葉1心期時(shí)將苗子轉(zhuǎn)移到苗缽中(直徑10cm,高15cm),每缽使用混合基質(zhì)約150g。1.3.3灌根、分離、種植將菌株TRI2接種于查氏培養(yǎng)基,25℃液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)大約10天,當(dāng)木霉菌孢子濃度達(dá)到2×107個(gè)/mL時(shí),將木霉菌發(fā)酵液與滅菌育苗基質(zhì)進(jìn)行充分混勻作為菌劑用于田間試驗(yàn),混合比例為每千克基質(zhì)加入300mL發(fā)酵液。當(dāng)黃瓜苗達(dá)到2葉1心期時(shí)將苗子