甜瓜枯萎病防治反應(yīng)及相關(guān)酶活性的變化

甜瓜枯萎病防治反應(yīng)及相關(guān)酶活性的變化

土壤養(yǎng)殖的風(fēng)險和南瓜萎縮，對生產(chǎn)和工業(yè)的危害十分嚴重。木霉(Trichodermaspp.)是一類普遍存在、已被廣泛應(yīng)用的生防因子。它能對多種病原菌產(chǎn)生拮抗作用,有效地抑制病原菌生長。植物內(nèi)生細菌由于定殖于宿主體內(nèi),有充足的營養(yǎng)來源,不易受外界逆境因子影響,與其它根際細菌、葉際附生細菌相比,其特定的生存環(huán)境更利于發(fā)揮生防作用,因而成為近年來倍受人們關(guān)注的生防因子。研究者們已經(jīng)從棉花、馬鈴薯、辣椒、玉米等植物中分離出大量的內(nèi)生細菌,并對內(nèi)生細菌的生防機制作了研究。但有關(guān)拮抗木霉和植物內(nèi)生細菌結(jié)合防治的研究卻不多見。本試驗在溫室內(nèi)應(yīng)用拮抗內(nèi)生細菌與木霉復(fù)合處理甜瓜,從防御酶系的變化分析其誘導(dǎo)甜瓜抗病性的生防機制。1材料和方法1.1綠色木霉屬viruspo型甜瓜品種為“齊甜一號”。枯草芽孢桿菌[Bacillussubtilis(Ehrenberg)Chon(1872)]B6菌株自甜瓜組織內(nèi)分離,綠色木霉(TrichodermaviridPers.exS.F.Gray)T23、甜瓜枯萎病菌[Fusariumoxysporumf.spmelonis(Leach)Syn]F由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物防治工程中心提供。1.2內(nèi)生細菌多樣性測定木霉T23在麥麩培養(yǎng)基(麥麩與水按質(zhì)量分數(shù)約1∶1混合,121℃濕熱滅菌45min)中25℃恒溫培養(yǎng)10~14d后,風(fēng)干粉碎,以1∶100比例與滅菌土混合。甜瓜枯萎病菌F在玉米粉砂土培養(yǎng)基(玉米粉1000g,洗凈的砂1000g,水1500ml)中25℃培養(yǎng)10~14d,風(fēng)干粉碎,以0.5∶100與滅菌土混合。內(nèi)生細菌B6在LB培養(yǎng)液中30℃振蕩(120r/min)培養(yǎng)48h,制成濃度約2×107cfu/ml的菌懸液。常規(guī)種子消毒處理,待芽長約1cm左右時播種。種子播種在滅菌土中,待甜瓜長出3片真葉后,進行接種。用注射器將菌懸液注入植株根圍土壤,單獨接種的處理每株接種10ml,復(fù)合接種的處理B6與T23各5ml,設(shè)清水為對照。試驗設(shè):①接種F;②接種F和T23;③接種F和B6;④同時接種T23、B6和F,共4個處理。每處理80盆,每盆播2粒種子,每處理3次重復(fù)。放入溫度約25℃的溫室中培養(yǎng),三葉期調(diào)查記錄發(fā)病情況。1.3例如，b2和b23的組合使用對瓜氨酸反應(yīng)反應(yīng)酶系統(tǒng)的影響1.3.1制備抗血球計數(shù)板上的藥物T23和病原菌F在PD液體培養(yǎng)基中28℃振蕩(120r/min)培養(yǎng)7~10d,血球計數(shù)板調(diào)整孢子濃度,制成5×106cfu/ml(T23)和1×106cfu/ml(F)的孢子懸液。1.3.2接收點3和s13種子處理和接種方法同1.2。誘導(dǎo)接種后72h挑戰(zhàn)接種F菌株,試驗共設(shè)8個處理:①CK(自來水);②接種T23;③接種B6;④接種T23后,挑戰(zhàn)接種F(T23+F);⑤接種B6后,挑戰(zhàn)接種F(B6+F);⑥同時接種T23和B6(T23+B6);⑦同時接種T23和B6后,挑戰(zhàn)接種F(T23+B6+F);⑧單獨接種F。1.3.3不接種、挑戰(zhàn)接種f的處理取甜瓜根用自來水快速沖洗后,用濾紙吸干,每個樣品稱取1g裝入自封袋,放入-70℃超低溫冰箱中保存。每個處理3次重復(fù)取樣。不接種F菌株的處理從接種后開始每隔48h取一次樣,至接種后的第8d;挑戰(zhàn)接種F的處理從接種F菌株后每隔48h取一次樣,至挑戰(zhàn)接種的第8d。將上述稱取的樣品,放入預(yù)冷的研缽中,加入3ml硼酸緩沖液(含有少量巰基乙醇)和少量石英砂,冰浴研磨成勻漿,轉(zhuǎn)移至離心管中,10000r/min、4℃離心20min,所得上清液即為酶的粗提取液,4℃保存。1.3.4酶法制備酶系統(tǒng),-1,3-葡聚糖酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)以L-苯丙氨酸為底物,按賈顯祿的方法測定,有改動;過氧化物酶(POD)以愈創(chuàng)木酚為底物,參照陳捷等的方法測定;多酚氧化酶(PPO)以鄰苯二酚為底物,參照李靖等的方法測定;β-1,3-葡聚糖酶以葡聚糖為底物,按高增貴、賈顯祿方法測定。酶粗提液及未知樣蛋白含量的測定參照Broadford方法,用考馬斯亮藍G-250法測定酶粗提液中的蛋白含量,以牛血清白蛋白作標準曲線。2結(jié)果與分析2.1不同菌株單獨和復(fù)合處理對抗性相關(guān)系數(shù)的影響在溫室內(nèi),B6和T23復(fù)合處理對甜瓜枯萎病的相對防效達82.22%,而B6菌株和T23菌株單獨處理相對防效分別為61.90%和33.33%,復(fù)合處理比單獨處理分別高32.8%和146.7%(表)。2.2不同復(fù)合接種對甜瓜根系pod活性的影響2.2.1PAL活性T23、B6、T23+B6誘導(dǎo)接種甜瓜幼苗后,PAL活性高于對照,但各處理間差異不大(圖1A)。單獨接種T23后酶活性逐漸上升,8d峰值達到2548.83U/g;單獨接種B6后,在2d出現(xiàn)一個酶活性高峰,后緩慢下降,于8d再次升高;T23與B6同時接種的處理,其變化趨勢與B6單獨處理相類似,但在6~8d活性稍高于單獨使用B6的處理。與之相比,接種F各處理的PAL活性出現(xiàn)了較大的變化(圖1B)。單獨接種F,PAL活性始終低于對照,且在前6d一直下降,8d時稍有回升;先接種T23,再挑戰(zhàn)接種F后,活性逐漸升高,于6d達高峰,為1914.05U/g,之后下降;先接種B6再挑戰(zhàn)接種F的處理酶活性先升高后下降,但其峰值變化不大;只有先接種T23和B6,再挑戰(zhàn)接種F的處理,在接種后的2d即出現(xiàn)一個明顯高于對照的峰值,為2290.12U/g,緩慢升高后,于8d再次出現(xiàn)一個更加明顯的大峰,其峰值為4162.87U/g,高出對照約4倍。從上述結(jié)果可以看出,T23和B6復(fù)合使用對PAL活性增強的影響要比兩者的單獨使用明顯,尤其在挑戰(zhàn)接種F后,兩者復(fù)合使用對PAL活性上升的幅度要比單獨使用高,持續(xù)時間更長。2.2.2POD活性如圖2A所示,在不接種F的處理中,甜瓜根系POD活性在復(fù)合接種B6與T23后的第2d顯著上升,出現(xiàn)酶活性高峰達1197.27U/g,之后有所下降,8d時又有所回升,其峰值為1180.14U/g;單獨接種B6的處理酶活性2~6d內(nèi)平穩(wěn)上升,變化不大,8d突然升高,峰值達1735.97U/g,高于其它處理;單獨接種T23后,POD活性變化不是十分明顯,8d峰值達805.93U/g。相比之下,復(fù)合接種T23與B6,再挑戰(zhàn)接種F,其POD活性變化十分顯著,第2d就出現(xiàn)一個酶活高峰,稍有下降后又繼續(xù)升高,到接種后8d,POD活性峰值達1931.99U/g,高出對照約10倍;接種B6后的處理在4d達活性高峰之后就開始下降,8d峰值達311.86U/g;接種T23后挑戰(zhàn)接種F的處理在6d出現(xiàn)一個酶活性高峰達685.84U/g,之后有所下降(圖2B)。由此可見,盡管在不接種F和接種F的各個處理中,B6和T23單獨接種對POD活性上升有促進作用,但在挑戰(zhàn)接種F之后,復(fù)合接種對POD活性上升的影響還是高于單獨接種。2.2.3PPO活性不接種F的各個處理,PPO活性變化范圍在439.85~679.64U/g之間(圖3A)。接種F的各個處理中(圖3B),單獨接種F的處理于2d即出現(xiàn)一個明顯的峰,峰值達760.85U/g,比對照高1.5倍,之后急驟下降,然后又稍為上升,但幅度不大,第8d酶活性達512.78U/g;接種T23后,挑戰(zhàn)接種F的處理,在接種后2d酶活性下降,且低于對照,之后逐漸上升,8d達高峰,酶活性達831.14U/g;B6+F的處理其PPO活性始終低于對照,呈下降趨勢;但B6和T23復(fù)合接種后再挑戰(zhàn)接種F,PPO活性急驟上升,明顯高于其他處理,8d達1040.91U/g,明顯高于對照463.94U/g。說明挑戰(zhàn)接種F比不接種F對甜瓜根系PPO活性的影響大,而且在挑戰(zhàn)接種F的處理中,T23和B6復(fù)合接種對PPO活性上升在接種后的8d之內(nèi)有持續(xù)的促進作用。2.2.4β-1,3-葡聚糖酶活性B6與T23復(fù)合接種后,β-1,3-葡聚糖酶活性急驟升高,是對照的5倍,第4d稍有下降,6~8d趨于平穩(wěn),酶活性變化較其他處理明顯;B6單獨接種后,酶活性較高,8d達78.33U/g;接種T23后,酶比活性變化趨勢稍低于對照。挑戰(zhàn)接種F后,β-1,3-葡聚糖酶活性變化趨勢與不接種F的變化趨勢相類似(圖4)。由此可以看出B6和T23復(fù)合接種能明顯誘導(dǎo)甜瓜根系β-1,3-葡聚糖酶活性的增強。3木霉與內(nèi)生細菌的復(fù)合誘導(dǎo)抗性多年來國內(nèi)外學(xué)者對木霉的生防應(yīng)用、生物藥劑開發(fā)以及生防機制做了許多嘗試和深入的研究,并相繼有商品化木霉制劑問世。其生防機理主要是木霉對病原菌有拮抗作用,可阻止病菌侵染,然而病菌一旦進入根系維管束便很難防治。此外高溫、干燥、化學(xué)農(nóng)藥、化肥、重金屬等逆境因子能干擾木霉在土壤內(nèi)的活性,而且對其在作物根表的定殖有明顯抑制作用。本研究應(yīng)用內(nèi)生枯草芽孢桿菌與綠色木霉復(fù)合處理防治甜瓜枯萎病,以彌補只能定殖于根表拮抗木霉的不足。通過溫室試驗的研究證明了木霉與內(nèi)生細菌復(fù)合處理可提高對甜瓜枯萎病的防治效果。植物誘導(dǎo)抗性的機制是多方面的,其中包括了與木質(zhì)素形成有關(guān)的苯丙烷類代謝途徑中有關(guān)酶活性的增加、植保素的合成以及病程相關(guān)蛋白(PRs)等多種生理生化因子。其中PAL、酚類氧化或縮合的POD、PPO、β-1,3-葡聚糖酶是植物防御反應(yīng)的重要酶系,成為國內(nèi)外許多學(xué)者在寄主與病原互作過程中評價植物抗病性的重要生理指標,尤其PAL是酚類物質(zhì)、植保素和木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶,植物在受到病原菌侵染或激發(fā)子刺激后PAL活性會首先上升。焦琮等用康氏木霉處理棉花和菜豆幼苗后,過氧化物酶活性提高。Elad等利用哈茨木霉T39接種根部或葉子后,控制了灰葡萄孢引起的病害,認為誘導(dǎo)抗性是重要機制之一。夏正俊等從棉花內(nèi)分離出