木薯抗細菌性枯萎病鑒定接種細菌懸浮液接種方法的比較

木薯抗細菌性枯萎病鑒定接種細菌懸浮液接種方法的比較

甘薯是一種耐旱、易稀釋的冬末谷物。與甘薯和甘薯一起被稱為三種谷物。這是亞熱帶和亞熱帶農(nóng)民的重要食物和經(jīng)濟收入來源之一。木薯細菌性枯萎病(病原菌:Xanthomonasaxonopodispv.manihotisVauterin,Kerters&Swings)是國內檢疫對象,該病最初報道在巴西發(fā)生,后蔓延至南美洲、非洲及亞洲部分國家。染病木薯危害嚴重,而化學防治難以奏效,病田一般減產(chǎn)30%～50%,嚴重時可絕收。該病菌隨種莖、薯干及種子等材料的調運進行遠距離傳播,具有帶菌未顯病癥的特點,病株組織含菌量小于3×102～104cfu/mL時,PCR擴增檢測不到特征性譜帶。傳統(tǒng)的植物檢疫手段存在局限性。隨著我國加入WTO并與疫區(qū)國家進行木薯產(chǎn)品的交流,木薯細菌性枯萎病在我國擴散危害的形勢十分嚴峻,如對該病控制不力,將對我國木薯生產(chǎn)構成嚴重威脅。我國木薯研究始于20世紀50年代,但工作多集中在品種資源的收集和保存、品種選育與推廣、高產(chǎn)栽培技術及深加工技術等方面。種植抗病品種是防治植物病害流行的經(jīng)濟有效的措施,但目前國內尚未見到對木薯細菌性枯萎病抗性鑒定技術研究的報道。因此,對木薯細菌性枯萎病進行抗源篩選、評價和利用缺乏依據(jù),制約了抗病育種工作的開展。為了探討木薯細菌性枯萎病抗性鑒定技術及其在抗病育種上的應用前景,本試驗于2007～2008年在隔離的玻璃網(wǎng)室內,對木薯細菌性枯萎病抗性測定方法進行了研究,以期為我國木薯抗病品種選育工作的開展提供技術支撐。1材料和方法1.1供試菌株鑒定以木薯細菌性枯萎病菌BH-1菌株為供試菌株。該菌株是從病害樣本(廣西植?？傉局参餀z疫站提供)分離獲得,經(jīng)柯氏法則測定致病性后在-30℃下保存。1.2試驗結果表明，甘薯品種供試木薯品種為GR911(廣西農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所提供)。1.3試驗內容和方法1.3.1細菌懸浮液的制備和接種將病菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(蛋白胨5g、牛肉膏3g、酵母膏1g、蔗糖10g、瓊脂17g、蒸餾水1000mL)上培養(yǎng)48h,再用無菌水配制成108cfu/mL細菌懸浮液備用。在木薯生育前期分別采用以下幾種方法進行接種:①刷葉法,用無菌牙刷蘸1次細菌懸浮液后輕刷1次小葉;②壓傷滴菌法,無菌膠頭滴管先吸取細菌懸浮液,再用滴管口輕壓小葉,使其形成微傷口,然后用手擠膠頭,滴一滴細菌懸浮液在微傷口上;③剪葉法,用無菌剪刀蘸1次細菌懸浮液后剪1張小葉,剪去葉尖的葉面積約占整張葉片面積的1/10;④普通針刺法,把針距為1.0cm×1.0cm的6根大頭針固定在橡皮上滅菌后,將其蘸1次細菌懸浮液后刺傷1張小葉;⑤傷根淋菌法,先對木薯根部進行翻耕傷根,然后用3×107cfu/mL細菌懸浮液淋根,每株淋1L,設3個重復,每個重復淋5株木薯;⑥噴霧法,用手提式噴霧器對木薯葉片均勻噴施細菌懸浮液,設3個重復,每個重復噴霧接種5株木薯,保濕2d,第10天后調查記載病情;⑦改良針刺法,把針距為1.0cm×1.0cm的4根大頭針固定在橡皮上滅菌備用。用直徑為9cm的無菌海綿吸足細菌懸浮液后置于培養(yǎng)皿內,在海綿上疊4～8張小葉,用帶橡皮的大頭針刺一下后,再將橡皮擠壓一下海綿至擠出菌液再拔出,每個重復刺5株木薯葉片,每株接種3～5次,第10天后調查記載病情,設3個重復,接種過程注意給海綿補充細菌懸浮液(下同)。以上的刷葉法、壓傷滴菌法、剪葉法、普通針刺法均設3個重復,每個重復接種5株木薯葉片,每株接種3～5張復葉,每張復葉接種4～7張小葉,接種后第10天調查記載病情。1.3.2針孔發(fā)病率調查將病菌用無菌水配成濃度為3×109cfu/mL的細菌懸浮液,逐級稀釋10倍,分別配制成3×108cfu/mL、3×107cfu/mL、3×106cfu/mL、3×105cfu/mL、3×104cfu/mL、3×103cfu/mL、3×102cfu/mL共8個濃度梯度后,在木薯生育前期用改良針刺法接種,分別在接種后第4天、第6天、第8天、第10天調查記載針孔發(fā)病率,第10天調查記載病情級別。1.3.3調查記錄及銜接在木薯生育前期分別對木薯葉片、莖稈、根部進行接種:對葉片用改良針刺法進行接種,接種后第10天、第15天分別調查記載病情級別;對莖稈用無菌解剖刀斜切皮部后再向下縱剖1～2cm,然后將帶菌棉團夾于斜切傷口部位,接種后分別在第15天、第30天分批測量莖稈病部褐變組織長度;對根部進行深翻傷根,然后每株用1L細菌懸浮液(3×106cfu/mL)淋根,接種后分別在第30天、第60天調查記載病情。1.3.4根據(jù)病斑長度分級標準分為5級和9級對于接種傷口較小的普通針刺法、改良針刺法均采用以下分級標準記載病情:0級為針孔無癥狀;1級為病斑長度小于0.5cm;3級為病斑長度0.6～1.5cm;5級為病斑長度1.6～2.5cm;7級為病斑長度2.6～4.0cm;9級為病斑長度大于4.0cm。而對于接種傷口較大的刷葉法、壓傷滴菌法、剪葉法及無傷接種的噴霧法、傷根淋菌法均采用以下分級標準記載病情:0級為葉片無病斑;1級為病斑占葉面積1/10以下;3級為病斑占葉面積1/10～1/4;5級為病斑占葉面積1/4～1/2;7級為病斑占葉面積1/2～3/4;9級為病斑占葉面積3/4以上。2結果與分析2.1接種后病情變幅不同接種方法的抗性鑒定結果見表1,采用噴霧法、傷根淋菌法接種不發(fā)病,其他接種方法接種后均發(fā)病,而且病葉率均較高(93.2%以上)。刷葉法、壓傷滴菌法、剪葉法3種方法接種后病情變幅較大,病指在3～9級。普通針刺法與改良針刺法接種后潛伏期為5～6d,病葉率較高(98.6%以上),病情變幅較小,病指在7～9級,較為穩(wěn)定。工作量以剪葉法與改良針刺法相對較少。2.2接種細菌懸浮液濃度試驗結果見表2,當接種細菌懸浮液濃度為3×102cfu/mL時,接種后第10～30天未觀察到病狀;接種細菌懸浮液濃度達3×103cfu/mL時,接種后第8～10天觀察到針孔發(fā)病;當接種細菌懸浮液濃度為3×107～3×108cfu/mL時,針孔發(fā)病率高,病情穩(wěn)定,接種后同一品種病株之間的病情級別變幅不大;當接種細菌懸浮液濃度達3×109cfu/mL時,病情級別均為9級;當接種細菌懸浮液濃度低于3×106cfu/mL時,同一品種病株之間的病情級別在0～9級。2.3髓部褐變組織生長情況植株不同部位的接種結果見表3,用改良針刺法對葉片進行接種,發(fā)病充分,兩年的病情結果穩(wěn)定。在木薯莖稈中上部斜切接種帶菌棉團,植株髓部褐變組織長度兩年的結果差異較大。采用菌液淋根法接種,兩年的結果一致,接種后第30～60天沒有觀察到植株葉片、莖稈髓部和根塊發(fā)病。3抗性鑒定方法的選擇當接種細菌懸浮液濃度達3×109cfu/mL時,植株發(fā)病快而且病情級別偏高,供試品種均表現(xiàn)為高感,而當接種細菌懸浮液濃度低于3×106cfu/mL時,植株發(fā)病慢且病情級別變幅較大,兩者均難以區(qū)分品種的抗感反應?？沙醪秸J為接種細菌懸浮液適宜濃度為3×107～3×108cfu/mL;改良針刺法和剪葉法由于工作量相對較少,對大批量品種進行抗性鑒定初篩宜采用改良針刺法或剪葉法,而復篩和抗性穩(wěn)定性測定再用普通針刺法進行篩選,其他接種方法因在同一品種上的病級變幅較大,難以表現(xiàn)品種的抗感性;接種的部位以葉片為宜,不僅發(fā)病充分,便于調查記載,而且兩年的試驗結果病情級別變幅不大,重復性好。對木薯細菌性枯萎病進行抗性鑒