藥食兩用揮發(fā)油的體外抗菌作用研究

藥食兩用揮發(fā)油的體外抗菌作用研究

隨著消費(fèi)者越來越重視食品的質(zhì)量，高效、低毒天然食品腐敗現(xiàn)象的提出和開發(fā)已成為各國食品研究的熱點(diǎn)。許多植物揮發(fā)油由于其特殊的化學(xué)組成,在很多研究中表現(xiàn)出了很好的抗菌活性,成為新的特效低毒防腐劑的重要源泉。丁香(Floscaryophylli)為桃金娘科植物丁香的干燥花蕾,其性辛溫,丁香花蕾揮發(fā)油的主要成分為丁香酚(eugenol),具有消炎、殺菌、驅(qū)蟲、鎮(zhèn)痛等功效。肉桂(CortexCinnamomi)為樟科植物肉桂的干燥樹皮,其性辛甘、大熱,肉桂皮揮發(fā)油的主要成分為肉桂醛(cinnamaldehyde),具有抗菌、消炎、鎮(zhèn)靜、止痛等功效。丁香和肉桂均是我國衛(wèi)生部公布的藥食兼用植物材料,既能食用,又是名貴中藥。有很多報(bào)道表明丁香和肉桂的揮發(fā)油有抑菌防腐作用,試驗(yàn)方法多是采用濾紙片法和傾注法,但濾紙片法受很多因素影響(如固體培養(yǎng)基表面水分含量及厚度等),使結(jié)果的不確定性增大;傾注法可在對大量EOs抗菌活性篩選時(shí)使用。為了考察液體環(huán)境下的抗菌活性,本實(shí)驗(yàn)采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行抑菌試驗(yàn),定量測定了丁香、肉桂及其主要成分丁香酚和肉桂醛的MIC,并與目前常用食品防腐劑苯甲酸鈉和山梨酸鉀的抗菌效果進(jìn)行了對比,從而為天然植物防腐劑開發(fā)和應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1生物技術(shù)及其助劑丁香(Floscaryophylli)、肉桂(CortexCinnamomi)北京市同仁堂藥店;肉桂醛(cinnamaldehyde)、丁香酚(eugenol)Sigma公司;M-H瓊脂(Mueller-HintonAgar,MHA)、M-H肉湯(Mueller-HintonBroth,MHB)北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司;無水乙醇(色譜純)天津市津科精細(xì)化工研究所;刃天青Sigma公司。1.1.2氫火焰離子分離器fidGC-14C氣相色譜分析儀日本島津公司(Shimadzu);氫火焰離子檢測器(FID);DM-1701石英毛細(xì)彈性管柱(30m×0.25mmi.d.×0.25μm)迪馬DIKMA公司;5μl微量進(jìn)樣器上海安亭微量進(jìn)樣器廠。1.1.3菌株和病毒種金黃色葡萄糖球菌(Staphylococcusaureus)AS1.89、大腸桿菌(Escherichiacoli)AS1.90、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)AS1.1849、沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)AS1.1174、志賀氏菌(Shigelladysenteriae)AS1.1869,以上菌種均購自中科院微生物所。1.2方法1.2.1揮發(fā)油的提取分別對丁香和肉桂原料進(jìn)行粉碎,各取粉末200g于5L的三口圓底燒瓶中,加入十倍量蒸餾水(M/V),浸泡1h,加熱料液采用水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油,蒸餾提取3h以上,加熱提取過程中隨時(shí)收集揮發(fā)油,提取結(jié)束后,合并揮發(fā)油,用無水硫酸鈉進(jìn)行脫水后移入棕色樣品瓶中,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2.2相位測試1.2.2.流速載氣(N2):15.6ml/min;分流比:1:20;燃?xì)?H2):45ml/min;助燃?xì)?空氣):450ml/min;尾氣流速:40ml/min;進(jìn)樣口溫度:250℃;FID檢測器溫度:250℃;進(jìn)樣量:1μl;(1)肉桂油程序升溫:初始100℃,以4℃/min的速度升至150℃,保持3min,再以4℃/min的速度升至210℃,保持5min;(2)丁香油程序升溫:初始100℃,以6℃/min的速度升至150℃,保持5min,再以4℃/min的速度升至210℃,保持5min。1.2.2.2.樣品溶液的制備以色譜純乙醇為溶劑,準(zhǔn)確配制樣品溶液:丁香油溶液1020mg/L,肉桂油溶液475mg/L。1.2.3worm試驗(yàn)1.2.3.%tween-80的蒸餾配制分別取丁香和肉桂揮發(fā)油適量,用0.22μm的微孔過濾器過濾除菌,并用經(jīng)滅菌處理的含1%Tween-80的蒸餾水配制成系列濃度藥液:12800、6400、3200、1600、800mg/L等;分別用滅菌蒸餾水配制苯甲酸鈉和山梨酸鉀系列濃度藥液:102400、51200、25600、12800、6400mg/L等。1.2.3.菌種活化與培養(yǎng)將5種供試菌種分別接種于若干M-H瓊脂斜面上,于37℃培養(yǎng)24h,進(jìn)行菌種活化?；罨蟮募?xì)菌做十倍系列稀釋,并活菌計(jì)數(shù)。用M-H肉湯將細(xì)菌分別配制成5×105CFU/ml濃度的細(xì)胞懸浮液。1.2.3.mic抑制法采用微量稀釋法測定最小抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration,MIC),即能抑制細(xì)菌生長的最低濃度。具體方法:首先在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入0.25g/L刃天青2μl;其次按照從低到高的順序每孔加入100μl藥液,并排三孔加同濃度藥液作平行;然后每孔中加入100μl菌液進(jìn)行接種,于37℃培養(yǎng)24h。結(jié)果判斷:刃天青本身為藍(lán)色,當(dāng)孔中有細(xì)菌生長則呈紅色。2結(jié)果與分析2.1揮發(fā)油的提取觀察提取過程可以看出,蒸餾初始時(shí)揮發(fā)油大量餾出,此后不久,揮發(fā)油餾出速率下降,一段時(shí)間后,隨著蒸餾的繼續(xù),揮發(fā)油量基本上不再增加。分析原因認(rèn)為在0.5～1h內(nèi),原料充分浸潤、溶脹,油水分離,揮發(fā)油與蒸汽形成共沸而快速揮發(fā),3h之內(nèi)96%以上的揮發(fā)油已經(jīng)提取出來,但隨時(shí)間推移,料液中油類組分的減少,油水比相應(yīng)降低,共沸點(diǎn)升高,揮發(fā)油餾出量減少。本試驗(yàn)記錄了肉桂揮發(fā)油的提取過程(圖1),肉桂油在1h內(nèi)出油速度很快,1～2h出油速度減緩,到2h時(shí)80%的肉桂揮發(fā)油餾出,3h后餾出油量基本上沒有較大的增加。經(jīng)水蒸汽蒸餾得到的丁香和肉桂揮發(fā)油的得率及觀察到的物理性質(zhì)見表1。2.2相位測試2.2.1m-171系統(tǒng)香辛料植物揮發(fā)油屬于揮發(fā)性有機(jī)物且其極性為弱極性,根據(jù)相似相溶原理,本實(shí)驗(yàn)采用DM-1701中極性柱,其固定相是聚二甲基硅氧烷。所用檢測器是氫火焰離子化檢測器(FID),可用來分析植物揮發(fā)油類含碳、氫的有機(jī)物,其優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、響應(yīng)快、線性范圍寬、定量準(zhǔn)確。由于植物揮發(fā)油組成成分復(fù)雜,本文中我們采用程序升溫進(jìn)行氣相測定。2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍以色譜純乙醇為溶劑,精確配置丁香酚系列標(biāo)準(zhǔn)溶液:123、246、492、1230、2460mg/L;肉桂醛系列標(biāo)準(zhǔn)溶液:66、132、264、528、1056mg/L。精密吸取各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液1μl測定色譜峰面積,以標(biāo)準(zhǔn)對照品濃度(mg/L)為橫坐標(biāo),峰面積積分值為縱坐標(biāo)分別作圖,得回歸方程為:丁香酚:y=293.63x-7654.6r=0.9999,在123～4920mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;肉桂醛:y=262.72x+93.918r=0.9999,在66～1056mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.2.3揮發(fā)油成分測定利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器設(shè)備,對丁香油和肉桂油進(jìn)行了氣相測定,如圖2、3。由圖可看出兩種揮發(fā)油的主要成分基本上實(shí)現(xiàn)了基線分離,滿足了對主要成分的測定要求。揮發(fā)油中主要成分是以保留時(shí)間定性,多點(diǎn)外標(biāo)法定量,積分參數(shù)為峰面積。肉桂和丁香揮發(fā)油的主要成分、化學(xué)結(jié)構(gòu)式、保留時(shí)間及百分含量見表2。2.3抗菌活性測定結(jié)果經(jīng)過大量的抗菌試驗(yàn),并對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了多次重復(fù)驗(yàn)證,試驗(yàn)結(jié)果表明,肉桂揮發(fā)油與其主要成分肉桂醛表現(xiàn)出的抗菌活性最強(qiáng),MIC為200～1600mg/L,僅為苯甲酸鈉和山梨酸鉀MIC的1/64～1/16;丁香油及其主要成分丁香酚的抗菌活性次之,MIC為800～1600mg/L,相當(dāng)于苯甲酸鈉和山梨酸鉀MIC的1/16～1/8;苯甲酸鈉和山梨酸鉀的MIC為6400～25600mg/L,抗菌效果較差。圖5采用最小抑菌濃度的倒數(shù)為抗菌活性指標(biāo),直觀地表現(xiàn)了試驗(yàn)藥品的抗菌活性。由圖6可知,丁香油和丁香酚除對沙門氏菌的抑制效果略有差別外,對另外4株試驗(yàn)菌的抗菌活性相當(dāng),其中對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和志賀氏菌的抗菌效果相同,MIC均為800mg/L;對枯草芽孢桿菌抗菌效果較之略差,MIC均為1600mg/L。由氣相測定結(jié)果可知,丁香酚是丁香油的主要成分(占78.1%),且表現(xiàn)出相似的抗菌活性,表明丁香酚是丁香油中起抗菌作用的主要物質(zhì),同時(shí),丁香油中還含有其它抗菌成分,使總抗菌效果相當(dāng)于丁香酚。由圖7可以看出,肉桂油和肉桂醛對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌表現(xiàn)出的抗菌作用相同,MIC分別為400和200mg/L;對大腸桿菌和志賀氏菌作用不同,肉桂油對大腸桿菌和志賀氏菌的MIC均為400mg/L;肉桂醛對這兩種菌的MIC為200mg/L,由此說明肉桂油中的其它成分對這兩株菌表現(xiàn)出的總抗菌活性比肉桂醛的差;但對枯草芽孢桿菌的抗菌情況正好相反,肉桂油的MIC為800mg/L,肉桂醛的MIC為1600mg/L,這可能是由于在對枯草芽孢桿菌抗菌過程中,肉桂油的某種成分與肉桂醛協(xié)同作用的結(jié)果,也可能是肉桂油中還含有對該菌作用較強(qiáng)的其它抗菌成分,這還有待于進(jìn)一步研究。3揮發(fā)油的檢測在確定提取時(shí)間時(shí),若提取時(shí)間過短,高沸點(diǎn)的成分還沒有蒸餾出來,則提取不完全,若提取時(shí)間過長,則會(huì)增大能耗,加大成本,所以提取時(shí)間選取3～4h為宜。揮發(fā)油的氣味,是其品質(zhì)優(yōu)劣的重要標(biāo)志。提取出來的揮發(fā)油,與空氣及光線接觸會(huì)逐漸氧化變質(zhì),使揮發(fā)油的比重增加,顏色變深,并形成樹脂狀物質(zhì),失去原有香味。因此,制備出來的揮發(fā)油應(yīng)立即用無水硫酸鈉除水,并用棕色瓶將其密封低溫保存,防止揮發(fā)油氧化及光敏反應(yīng)。本試驗(yàn)建立了丁香油和肉桂油主要成分的氣相色譜檢測方法。該方法靈敏度高、測定速度快、操作簡單,在本實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)條件下切實(shí)可行。在此檢測方法下,揮發(fā)油中各組分得到充分有效的分離,達(dá)到了對其中主要成分測定的要求。本實(shí)驗(yàn)只作了對揮發(fā)油中主要成分的定性定量測定,沒有進(jìn)一步通過氣質(zhì)聯(lián)用對揮發(fā)油的所有成分進(jìn)行檢測,如在今后的研究中有進(jìn)一步確定揮發(fā)油組分的需要,可在此氣相測定條件下進(jìn)行氣質(zhì)分析。丁香和肉桂揮發(fā)油及其主要成分對5株試驗(yàn)菌的抑制效果明顯強(qiáng)于常用食品防腐劑苯甲酸鈉苯甲酸鈉和山梨酸鉀。其中,肉桂揮發(fā)油與肉桂醛的MIC(200～1600mg/L)僅為苯甲酸鈉和山梨酸