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PCR試驗(yàn)指南第一局部一、 根本步驟:1、目的基因〔DNA和mRNA〕的查找和比對(duì);2、引物、探針的設(shè)計(jì);3、引物探針的合成;4、反響體系的配制;5、反響條件的設(shè)定;6、反響體系和條件的優(yōu)化;7、熒光曲線和數(shù)據(jù)分析;8、標(biāo)準(zhǔn)品的制備;二、技術(shù)關(guān)鍵:1〔DNA和mRNA〕的查找和比對(duì);從“:///網(wǎng)點(diǎn)的“:///網(wǎng)點(diǎn)的genbank中下載所需要的序列。下載的方式有兩種:一為翻開某個(gè)序列后,直接點(diǎn)擊“save”,保存格式為“.txt”文件。保存的名稱中要包括序列的物DNAstar軟件中的Editseq軟件,點(diǎn)擊“file”菜單中的“import”,翻開后點(diǎn)擊“save”,保存為“.seq”DNAstar軟件中的Editseq“file”菜單中的“openentrezsequence”,導(dǎo)入后保存為“.seq”文件,保存的名稱中要包括序列的物種、序列的DNAstar軟件中的Seqman軟件,點(diǎn)擊“sequence”菜單中的“add”,選擇要比較的“.seq”的全部文件,點(diǎn)擊“add”或“addall”,然后點(diǎn)擊“Done”“assemble”進(jìn)展比較。橫線的參數(shù)設(shè)置的緣由,可能分為幾組(contig),假設(shè)想全部放在一組中進(jìn)展比較,就調(diào)整“project”菜單下的“parameter”,在“assembling”內(nèi)的“minimummathpercentage”默認(rèn)設(shè)置為80,“contig”菜單下的“reassemblecontig”即可。選擇凹凸的原則是在保證所分析的序列在一個(gè)“contig”內(nèi)的前提下,盡量提高“minimummathpercentage”,要對(duì)“contig”的序列的排列進(jìn)展修改,確保排列是每個(gè)序列的真實(shí)且排列同源性最好的排列。然后,點(diǎn)擊“save”的紅色是不行用的。2、引物和探針設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)PCR中最重要的一步。抱負(fù)的引物對(duì)只加特異性的引物所具有的令人滿足的特點(diǎn):2序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段;2擴(kuò)增片段長(zhǎng)度依據(jù)技術(shù)的不同有所分別:sybrgreenI技術(shù)對(duì)片段長(zhǎng)度沒有特別要求;Taqman50bp-150bp;244個(gè)以上連續(xù)配對(duì);2避開引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡構(gòu)造;21824個(gè)核苷長(zhǎng)。引物需要足夠長(zhǎng),保證序列獨(dú)24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長(zhǎng)的序列可能會(huì)而降低了產(chǎn)量。Tm值在55-65℃,GC含量在40%-60%;2TM2℃;23’A;23’33個(gè)以上連續(xù)一樣的堿基。2為避開基因組的擴(kuò)增,引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯子。Taqman探針設(shè)計(jì)一般設(shè)計(jì)原則:2探針位置盡可能地靠近上游引物;225-35bp,Tm65-70℃,通常比引物TM5-10℃,GC40%-70%。25’G。2CG的含量。2blast中核實(shí)一次,假設(shè)覺察有非特異性互補(bǔ)區(qū),建議重設(shè)計(jì)引物探針。“:///BLAST)“(/BLAST)TaqmanMGB探針設(shè)計(jì)介紹MGB探針的優(yōu)點(diǎn):2MGB探針較短(14-20bp),更簡(jiǎn)潔找到全部排序序列的較短片段的保守區(qū)。2短片段探針(14-20bp)加上MGB后,Tm值將提高10℃,更簡(jiǎn)潔Tm值的要求。2MGB探針的設(shè)計(jì)原則5G堿基仍可淬滅基團(tuán)的熒光信號(hào)。2用primerexpress軟件評(píng)價(jià)Tm值,Tm65-67℃。2盡量縮短TaqmanMGB13bp。2G4個(gè)或4G重復(fù)消滅。2原則上MGB探針只要有一個(gè)堿基突變,MGB探針就會(huì)檢測(cè)到(MGB探針將不會(huì)與目的片段雜交,不產(chǎn)生熒光信號(hào))。因此,在進(jìn)展SNPTaqmanMGB檢測(cè)將探針的突變位點(diǎn)盡量放在中間1/3的地方。留意:為了滿4個(gè)條件,探針的突變位點(diǎn)可向3’端移動(dòng),但突變3’2個(gè)堿基的前方(即必需確保探針的后兩個(gè)堿基是確定的保守),以進(jìn)展SNP檢測(cè)。反過(guò)來(lái),假設(shè)要進(jìn)展同類檢測(cè),找的是保守片段區(qū),探針中不應(yīng)有突變位點(diǎn)。假設(shè)探針即便是13bp,探針仍不完全保守。有幾個(gè)突變,突變位點(diǎn)也應(yīng)產(chǎn)生熒光信號(hào)。另一種方法是設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并探針,也可到達(dá)即使是突變,仍可檢測(cè)到突變。實(shí)時(shí)多重PCR探針的選擇:多重實(shí)時(shí)PCRSYBRN染料,最終依據(jù)不同目的片段的Tm值來(lái)判定不同的物品。多重實(shí)時(shí)PCRTaqman探MGBBeacon探針。在多重PCRPCR的各個(gè)引物之間相互干擾和各個(gè)探針之間相互干擾分析:DNAstar軟件中的Primerselect軟件,翻開保守在同一文件中的多重PCR的引物計(jì)的多重探針后,在“report”菜單下“primerpairdimers”,分析上dimers。彈出的窗口中就告知此對(duì)引物有多少個(gè)dimerdG值進(jìn)展評(píng)價(jià)(dG理論上是dG值越大越好)。3、影響PCRPCR的其他因素PCR的探針并進(jìn)展設(shè)計(jì)對(duì)于實(shí)時(shí)熒光PCR尤其重要??梢哉f(shuō),不合理的設(shè)計(jì)意味著確定的失敗。但是,好的設(shè)計(jì)并不等于好的試驗(yàn)結(jié)果,影響PCR和熒光PCR的因素格外多,下面擇其重要進(jìn)展介紹。引物退火溫度引物的一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度〔Tm〕。這是當(dāng)50%的引物和DNATm對(duì)于設(shè)定PCR退合理的退火溫度從55℃到70Tm5℃。設(shè)定TmTm——從序列一級(jí)構(gòu)造和相鄰oligo軟件會(huì)自動(dòng)計(jì)算引物的Tm值。在設(shè)置退火溫度時(shí)可以如下進(jìn)展:以低于估算的Tm5℃作為起始的退火溫度,以2℃為增量,逐步提高退火溫TmTm5℃,就會(huì)由于在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。假設(shè)兩個(gè)引物Tm不同,將退火溫度設(shè)定Tm5℃?;蛘邽榱颂岣咛禺愋裕梢栽谝罁?jù)較高Tm5個(gè)循環(huán),然后再依據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)得目的模板的局部拷貝。引物濃度0.1到0.5μM。較高的引物濃度會(huì)導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。為了確定引物濃度260nm〔OD260〕測(cè)量光密度值。然后使用光吸取值〔nmol/OBeers〔1〕計(jì)算引物濃度。微摩消光系數(shù)可以使用公式2計(jì)算。與大分子雙鏈DNA使用計(jì)算的消光系數(shù)。這是由于引物較短,堿基組成差異很大。在oligo〔OD/μmol〕和消光系數(shù)的倒數(shù)〔μmol/OD〕。O.D.值表示量的多少,在一般狀況下,20個(gè)堿基長(zhǎng)的引物,1個(gè)O.D.100ul水后引物濃度為50pmol/ul〔50μM〕OLIGO軟件,依據(jù)引物的的消濃度(μM)=A260〔OD/ml〕×稀釋系數(shù)×消光系數(shù)的倒數(shù)〔nmol/OD〕舉例:計(jì)算某寡核苷酸〔1ml水中〕,10μl稀釋100倍〔參加990μl〕水中。在A260處測(cè)吸光度為0.2。計(jì)算消4.8nmol/OD,代入得:引物、探針的純度和穩(wěn)定性PCR應(yīng)用是足夠的。局部應(yīng)用DNA100%。這是個(gè)循環(huán)DNA3”到5”合成。在任何一個(gè)循環(huán)都可能失敗。較長(zhǎng)的引物,尤其是大于50個(gè)堿基,截?cái)嘈蛄械谋壤艽螅赡苄枰兓?。形式運(yùn)輸。最好在TE重溶引物,使其最終濃度為100μM。也可以用雙蒸水溶解。引物的穩(wěn)定性依靠于儲(chǔ)存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲(chǔ)存在-2010μMTE的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個(gè)月,但在室溫〔1530℃〕1周。干粉引物可以在-201年,在室溫〔1530℃〕最多可以2個(gè)月。針標(biāo)記效率和純度有很大的區(qū)分。2uM〔10×〕,作為工作濃度分裝多支,避光保存。熱啟動(dòng)熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外,提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管TaqDNA聚合酶的最正確延長(zhǎng)溫度在72PCRDNAPCR尤為有效。限制TaqDNAPCR反響PCR儀。這種方法簡(jiǎn)潔廉價(jià),但并不能DNAPCR儀到達(dá)TaqDNA聚合酶在內(nèi)的大局部手工Transitor?HotStartTaq酶對(duì)于自動(dòng)熱啟動(dòng)PCR來(lái)說(shuō)高效可靠。Transitor?HotStartTaq是在常規(guī)Taq酶的根底上進(jìn)展了化學(xué)修飾,使得該酶在低溫或常溫下沒有酶活,因此在加樣至PCR隨著PCR擴(kuò)增的進(jìn)展,酶活會(huì)被逐步釋放,有效提高擴(kuò)增效率及產(chǎn)物量。Transitor?HotStartTaqDNA聚合酶在變性步驟的9520分鐘才會(huì)被釋放到反響中,從而完全恢復(fù)聚合酶活性。鎂離子濃度PCR的多個(gè)方面,如DNA聚合酶的活性,這會(huì)影響產(chǎn)量;再如引物退火,這會(huì)影響特異性。dNTP度對(duì)于不同的引物對(duì)和模板都不同,但是包含200μMdNTP的實(shí)時(shí)定量,使用3到5mM〔一般PCR是1.5mM〕PCR1mM3mM,以0.5mM遞增,進(jìn)展鎂離子滴定。為削減Transitor?HotStartTaq酶。Transitor?HotStartTaqDNA聚合酶能夠在比一般的TaqDNA聚合酶更廣的鎂離子濃度范圍內(nèi)保持功能,因此僅需較少的優(yōu)化。模板質(zhì)量模板的質(zhì)量會(huì)影響產(chǎn)量。DNA樣品中覺察有多種污染物會(huì)抑制DNASDS,在0.01%時(shí)就會(huì)抑制擴(kuò)增反響。分別基因組DNA較的DNAZol,一種胍去垢劑裂解液,以及FTAGeneGuardSystem,其可以同基質(zhì)結(jié)合,在血液及其他生物樣品中純化貯存DNA。應(yīng)留意進(jìn)展PCR反響的模板質(zhì)量,以增加PCR反響的成功率。模板濃度PCR擴(kuò)增和熒光PCR104106個(gè)起始目的分子就足以觀測(cè)到好的熒光或在溴化乙錠染色膠上觀看到。所需的最正確模板量取決于基因組的大小〔下表〕。舉例說(shuō),100ng1μg的人類基因組DNA3×1043×105個(gè)分子,足以檢測(cè)到單拷貝基因的PCR產(chǎn)物。質(zhì)粒DNAPCR中的DNA的量是pg級(jí)的。對(duì)于一般的檢測(cè)樣品,10-100ng的量就足夠PCR而言是格外簡(jiǎn)潔,且能分析擴(kuò)增效率。1.基因組大小和分子數(shù)目的比例基因組基因組DNASize(bp)*TargetAmountofE.E.coliSaccharomycescerevisiaeArabidopsisthalianaDrosophilamelanogasterHomosapiensXenopuslaevis1.0MusmusculusZeamayspUC18plasmidDNAMolecules/μgofGenomicDNADNA(μg)for-10^5Molecules4.7×1061.8×1080.0012.0×1074.5×1070.017.0×1071.3×1070.011.6×1086.6×1050.52.8×1093.2×1051.02.9×1093.1×1051.03.3×1092.7×1051.01.5×10106.0×1042.02.69×1033.4×10111×10-63.8 3.8 防止剩余〔Carry-over〕污染PCR易受污染的影響,由于它是一種敏感的擴(kuò)增技術(shù)。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴(kuò)增。當(dāng)前一次擴(kuò)增產(chǎn)物用來(lái)進(jìn)展的擴(kuò)增反響時(shí),會(huì)發(fā)生共同來(lái)源的污染。這稱之為殘DNADNA也會(huì)是污染源〔非剩余污染〕??梢栽赑CR過(guò)程中使用良好的試驗(yàn)步驟削減剩余污染。使用帶eppendorf管內(nèi)。為PCR樣品配制和擴(kuò)增后分析設(shè)計(jì)隔離的區(qū)域,在預(yù)備反響前更換手套??偸鞘褂貌缓心0宓年幮员日諜z測(cè)污染。。DNA〔UD這種酶〔也稱為尿嘧啶-N-UNG〕DNA中的尿DNA區(qū)分開來(lái)。由于前面的擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)UDG敏感,全部可以在PCR前對(duì)配制的反響用UDG處理以破壞剩余產(chǎn)物。其次局部1PCR試劑體系影響PCR的因素如此之多,您有時(shí)很難區(qū)分是什么導(dǎo)致您的試驗(yàn)結(jié)果不佳。降低試驗(yàn)的不穩(wěn)定因素是使用優(yōu)質(zhì)牢靠的產(chǎn)品。dNTP、Mg離子、UNG/dUTP防污染系統(tǒng)預(yù)混成的定量PCR試劑體系,最大程度進(jìn)展以下步驟的預(yù)備:設(shè)計(jì)引物和探針、合成引物和探針、正確就能得到好的試驗(yàn)結(jié)果。FQPCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕同競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手的定量PCR體系相比供給了更優(yōu)異的結(jié)果。使用這種產(chǎn)品,您可以在您的PCR中得到更好特異性和更高的靈敏度,同時(shí)可以敏捷地選擇您所寵愛的擴(kuò)增條件,檢測(cè)方法和設(shè)備。實(shí)時(shí)定量PCR是快速增長(zhǎng)的PCR方法,它可以準(zhǔn)確、可重復(fù)地定量起始物質(zhì)。FQPCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕是光PCR所必需的成分〔如緩沖液,dNTP,聚合酶。只需參加您的模板,擴(kuò)增引物和熒光標(biāo)記探針。您就可以得到實(shí)時(shí)qPCR所需的特異性和敏捷性。hotstartTaqkit(A2023A0106),來(lái)配制不含有UNG/dUTPPCR體系。hotstartTaq酶,UNG酶和dNTPS,來(lái)配制含有UNG/dUTPPCR體系。量PCR試劑體系!高產(chǎn)量和特異性的擴(kuò)增FQPCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕PCR擴(kuò)TaqDNA聚合酶具有熱啟得到較高產(chǎn)量,并增加特異性。整合的UDG〔DNA糖基化酶〕DNA的擴(kuò)增,從而降低了假陽(yáng)性,使結(jié)果更牢靠。在產(chǎn)量和靈敏度方面,QuantitativePCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕的靈敏度極高〔閾循環(huán)〕。您可以更準(zhǔn)確地定量低拷貝的基因,并在較寬的目的濃度范圍內(nèi)檢測(cè)線性劑量反響。高度敏捷性除了靈敏度和特異性外,UniversalPCRMasterMixKit在分析設(shè)置,檢測(cè)方法和設(shè)備上給您供給了較高的自由度。使用UniversalPCRMasterMixKit,您可以:Mix體系。PCRPCR??梢栽诙喾N設(shè)備上使用,如ABIPrism?7700,ABIGeneAmp?5700Bio-Rad的I-Cycler。TaqMan?探針和MolecularBeacon,您不必局限于特定的試劑盒。PCR體系,不管是含UNG/dUTP防污染系統(tǒng)還是不含該系統(tǒng)的。2A2023A0101試劑盒:〔探針體系〕FQ-PCRMasterMix-UNG混合物(2X)25ul〔終濃度為1×〕;上游引物〔終濃度為50~900nM〕〔可先設(shè)200nM〕,下游引物〔終濃度為50~900nM〕〔可先設(shè)200nM〕;探針〔終濃度200nM〕;5ul〔10~100ng〕;無(wú)菌去離子水補(bǔ)足,使總體積到達(dá)50ul。您可以選擇熒光染料SYBGREEN體系,具體請(qǐng)參照說(shuō)明書。20-50ul間其他體積,留意保證終濃度一樣。A2023A0106:反響體系終濃度(自配熱啟動(dòng)熒光系統(tǒng)):1-2U的hotstartTaq酶、3-5.5mM的Mg2+ 、0.2mM的dNTPs、1×PCRbuffer〔A2023A0106〕;50-900nM的上游引物〔可先設(shè)200nM〕、50-900nM的下游引物〔可先設(shè)200nM200nM的探通常取2-5ul的模,無(wú)菌去離子水足,反響總體積通常為20-50ulUNG體系:1-2U的Taq酶、1×PCRbuffer、2.5-4.0mM的Mg2+〔A2023A0105〕;0.2-1U的UNG酶(A2023A0107)〔可先設(shè)0.5U〕、0.2mM的d(A,C,G)TPs、0.2-0.4mMdUTP〔要調(diào)整〕(A2023A0108);50-900nM的上游引物〔200nM〕、50-900nM的下游引物〔200nM〕、200nM的探針、通2-5ul20-50ul。3、反響體系和條件的優(yōu)化:使用高產(chǎn)量,特異和敏捷的定量PCR試劑體系FQPCR MASTERMix-UDG〔hotstart〕,優(yōu)化參數(shù)最少。您只需PCR,您可以優(yōu)化引物濃度,來(lái)得到更特異或更靈敏的結(jié)果。使用通用PCRMasterMix合更多的反響體系,如mRNA的一般RT-PCR檢測(cè),適用于合成質(zhì)粒的PCRPCR,范圍更寬。hotstartTaq酶kit(A2023A0106),該試劑盒中含有或不適宜產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)。您需要依據(jù)以下原則進(jìn)展優(yōu)化:1、您需要對(duì)酶量和鎂離子濃度進(jìn)展優(yōu)化。酶的推舉反響濃度為1.25-1.5〔50u1-2UMg離子推舉濃度一般PCR1-3mM,熒光PCR終濃3-5.5mM,請(qǐng)?jiān)谠摲秶鷥?nèi)探討最正確條件。2dNTP已經(jīng)預(yù)混,能夠充分保證產(chǎn)品質(zhì)量和PCR的忠實(shí)性。dNTP0.2mM的濃度即可。3、另外,上游引物和下游引物濃度可先設(shè)為200nM。當(dāng)結(jié)果不50nM-900nM之間進(jìn)展探討。Taqman200nM,不須探討。選擇其他種類的探針需依據(jù)要求設(shè)置探針濃度。5、可以先用推舉的反響條件,假設(shè)結(jié)果不佳,可依據(jù)引物、探針設(shè)計(jì)的具體狀況適合的退火溫度,退火時(shí)間和循環(huán)數(shù)。6、DNA100ng以下,因不同種類的DNA定最正確的DNA2StepRT-PCR反響的其次步PCRRTDNA模板時(shí)的PCR10%。7、稀釋全部探針、引物或配制模板請(qǐng)使用無(wú)菌雙蒸水或Tris溶RNA反響應(yīng)承受無(wú)RNA降解酶的水和容器進(jìn)展操作。如承受hotstartTaqA2023A0101一樣的熱啟動(dòng)熒光體系〔UNG/dUTP防污染體系〕,您可以選擇A2023A0105,A2023A0107和A2023A0108進(jìn)展。與A2023A0106不同的是除了以上的優(yōu)化步驟外,還增加了對(duì)UNG/dUTP系統(tǒng)進(jìn)展探討。建議先使用A2023A0106優(yōu)化好產(chǎn)品體系后,再來(lái)優(yōu)化該防污染系統(tǒng)。0.2-1U的UNG酶(A2023A0107)〔0.5U〕、0.2mM的d(A,C,G)TPs、0.2-0.4mMdUTP(A2023A0108)。反響條件如酶量、Mg離子等都已經(jīng)調(diào)好〔A2023A0106〕,您可以固定d(A,C,G)TPs0.2mM,并設(shè)定UNG濃度為0.5U(50ul),dUTP濃度也設(shè)為0.2mM,初步來(lái)看反響結(jié)果。如dUTP濃度〔上調(diào)。直至得到滿足結(jié)果。并可進(jìn)展防污染力量測(cè)試〔U的擴(kuò)增片斷進(jìn)展〕。3:影響PCRPCR的其他因素進(jìn)展優(yōu)化??傊瑑?yōu)化的指標(biāo)越多,試驗(yàn)的不確定性就越大。避開在操作中引入更QPCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕使用留意事項(xiàng)。4、適用的熒光儀器、試驗(yàn)設(shè)計(jì)、熒光曲線和數(shù)據(jù)分析;PCR儀:其中包括ABI7700,ABI7900,ABI7000(AppliedBiosystems);MX4000(Stratagene);iCycler(Bio-Rad);Smartcycler(Cepheid);Robocycler(MJResearch);Lightcycler(Roche);ROTORGENE(CORBERT);杭州博日〔Linegene〕。不同的儀器使用方法有所區(qū)分,但都具備對(duì)Taqman探針和sybgreen染料法的檢測(cè)波長(zhǎng)和檢測(cè)力量。QPCR MASTERMix-UDG〔hotstart〕和通用PCRMasterMix均適合在這些儀器上進(jìn)展使用。4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)2個(gè)復(fù)孔。個(gè)循環(huán)的熒光值作為閥值,也可以以陰性比照熒光值的最高點(diǎn)作為基線??赡芫売山ㄗh解決方法定量DNA模板DMSO,SDSTaqDNA聚合酶。染了抑制劑,可以使用乙醇量或很 沉淀DNA少的擴(kuò)PCR引物避開在引物3”端含有互補(bǔ)序列。避開可增產(chǎn)量設(shè)計(jì)較差 似的引物。比對(duì),設(shè)計(jì)符合差 要求的探針PCR引物用一般電泳法,看引物的設(shè)計(jì)和合成質(zhì)合成較差 量,是否有目的條帶消滅。熒光探針無(wú)確保探針設(shè)計(jì)的有效性和fluorophore功能 和quencher的存在。用DNaseTaqMan否增加。必要的話設(shè)計(jì)和合成探針。10^42530低 個(gè)循環(huán)中獲得信號(hào)。鎂離子濃度從3mM到5mM間隔0.5mM進(jìn)展一系列太低 應(yīng),確定對(duì)于每個(gè)模板和引物對(duì)的最正確試劑盒不需優(yōu)化鎂離子濃度。介于0.1μM到0.5μM之低 間。為了準(zhǔn)確確定引物濃度,在260nm測(cè)量光密度,然后使用光吸取值和消光系數(shù)計(jì)算濃度。〔見公式1〕選擇優(yōu)質(zhì)酶選擇hotstartTaq酶進(jìn)展擴(kuò)增,可提進(jìn)展擴(kuò)增 高靈敏度,增加產(chǎn)量,降低干擾因素退火溫度太使用表4的公式估算Tm,把退火溫度設(shè)高 由于這些公式只是估算Tm些或低些。PCR承受無(wú)菌無(wú)酶無(wú)熱源的離心管進(jìn)展試劑的分裝和使用。定量 引物、探針反響成分是否漏加;確定反響條件是否PCR性比照原來(lái)合成質(zhì)無(wú)擴(kuò)增量已閱歷
題還是體系的問(wèn)題;〔優(yōu)化好
確認(rèn)體系:1、引物是否降解〔看擴(kuò)增產(chǎn)來(lái)推斷引物和酶功能;2〔DNase處理TaqMan的體系〕 驗(yàn)熒光是否增加〕。儀器是否正常工作定量 模板或PCR隔離污染來(lái)源,更換試劑。陰剩余污染性比照線
使用UNG/dUTP使用專用的精巧移液器。在無(wú)DNA的吸頭。體系有問(wèn)題酶濃度不對(duì),Mg離子濃度不對(duì)定量 引物二聚體檢查引物設(shè)計(jì)和合成環(huán)節(jié),必要時(shí)更改PCR〔染多 引物料法出更換熱啟動(dòng)熱啟動(dòng)酶能增加反響的特異性,提高靈現(xiàn)非特酶 敏度異信號(hào)〔此時(shí)引〕定量 無(wú)cDNA合RT-PCR成無(wú)擴(kuò)增cDNA合成降低保溫溫度產(chǎn)量 溫度太高相對(duì)熒反轉(zhuǎn)錄cDNA提高保溫溫度。重設(shè)計(jì)引物光信號(hào)產(chǎn)物被二級(jí)小于等構(gòu)造封閉于背景RNARNA或沒有害或降解模板對(duì)RNAse污維持無(wú)菌條件;參加RNase抑制劑照 染熒光探針無(wú)確保探針設(shè)計(jì)的有效性和fluorophore功能和quencher用DNase處理TaqMan否增加。必要的話設(shè)計(jì)和合成探針。靈敏度初始模板RNA10ng-1μg低RNA總RNA須在比預(yù)期更RNA被損害和降解必要的話更換RNA高的循RNAseRNase環(huán)中檢染出產(chǎn)物無(wú)效
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