硝酸毛果蕓香堿眼用亞微乳的制備及評價

硝酸毛果蕓香堿眼用亞微乳的制備及評價

硝基苯乙烯酸酯（pn）是最常用的膽堿藥物之一。已經使用了100多年。它直接刺激了膜和帝國之間的中毒卓堿m的受體，導致膜和帝國之間的收縮，打開前屋角，促進梁網結構在前突乳突，并產生抗折射效應。由于水溶性好,PN在眼科臨床使用的制劑主要是其溶液劑(PNs)和凝膠劑(PN-gel)。與普通滴眼劑類似,因角結膜囊體積小且眼部存在保護性生理作用(包括眨眼、眼球轉動和流淚等),PNs在眼表的滯留時間短,眼部生物利用度低(0.1%~3%),藥效維持時間較短,需頻繁給藥(4次/天)。PN-gel可實現1次/天給藥,但其制劑黏度較大(600mPa·s左右),存在糊視和劑量不準確等不足。針對硝酸毛果蕓香堿在臨床應用中的局限性,研究其新型藥物傳遞系統顯得尤為重要。其中,亞微乳(submicroemulsion,SE)作為一種新型的眼部給藥系統,具有改善難溶性藥物溶解度,增加藥物脂溶性,減小刺激性,緩釋以及提高眼部生物利用度等優(yōu)點。因此PN/SE可增加PN的脂溶性,進一步提高PN的角膜滲透性,有利于其進入虹膜和睫狀肌作用部位,促進吸收。另外,滯留在角結膜囊內的亞微乳可作為藥物儲庫,持續(xù)釋放藥物,實現一定緩釋效果。近年來,研究發(fā)現陽離子型眼用亞微乳在眼表鋪展更加均勻,并能與眼表帶負電的黏蛋白產生靜電吸附,眼表滯留時間更長,有利于藥物持續(xù)吸收。殼聚糖(chitosan,CS)作為一種天然陽離子型黏多糖,具有無毒性、生物黏附性、生物相容性、促滲透性和生物可降解性等眾多優(yōu)良的生物學性質,已被廣泛應用于眼用制劑的研究中。本研究將PN包裹于亞微乳中,繼而與CS醋酸溶液孵育使得CS包覆在乳滴表面,制成具有黏膜黏附性的亞微乳CS-PN/SE,并對其理化性質和微觀形態(tài)進行了表征。另外,以硝酸毛果蕓香堿的眼用亞微乳PN/SE及溶液劑PNs為對照組,評價了CS-PN/SE在兔眼表滯留特性和縮瞳作用。cs-pn/se的制備儀器動態(tài)光散射粒徑測定儀(3000HS,馬爾文公司,英國);高速分散均質機(FJ-200,上海標本模型廠);旋轉流變儀(DV-III,Brookfield公司,美國);透射電子顯微鏡(H-7650,HITACHI日立集團,日本);HP1100高效液相色譜系統(包括G1311四元泵,G1379A在線脫氣機,G1328B手動進樣器,G1314AVWD檢測器,數據處理色譜工作站:HPchemstationRev.A.10.01,Agilent公司,美國)。藥品與試劑硝酸毛果蕓香堿(PN,純度98%,巴西進口,廣東利瑋醫(yī)藥有限公司分裝);硝酸毛果蕓香堿溶液劑(PNs,1%,w/v,山東博士倫福瑞達制藥有限公司);中鏈甘油三酸酯(MCT,德國Lipoid公司);Tween80,Span80及甘油(南京威爾化工有限公司);油酸(馬來西亞進口,江蘇無錫市多利佳貿易有限公司);殼聚糖(CS,分子質量約為150kD,脫乙酰度95%,浙江金殼生物科技有限公司);其他試劑均為國產色譜純或分析純。動物新西蘭白兔,體重(2.5±0.5)kg,中國藥科大學實驗動物中心提供。(19±1)℃,(50±5)RH,(20±5)lux下于標準籠中飼養(yǎng),同時標準飲食,任意飲水。油水分配系數的測定精密稱取PN約800mg至10mL量瓶中,用正辛醇飽和的水完全溶解,定容,移取5mL至具塞試管中,加入被水飽和的正辛醇5mL,制得水-正辛醇(1∶1)的分配液。渦旋30min后,4000r·min-1離心10min,移取水層20μL至50mL量瓶,用正辛醇飽和的水定容至刻度,在220nm波長處測定吸收度,代入標準曲線(A=0.0397C-0.0139,R2=0.9998)中得到水相中藥物濃度,用公式P=(C-Cw)/Cw計算表觀油水分配系數(C指原來水相中藥物濃度,Cw指平衡后水相中藥物濃度)。同法操作3次,取平均值。PN溶解度的測定測定PN在去離子水、不同的油(Soybeanoil、Castoroil和MCT)、表面活性劑(Tween80、Span80、Poloxamer188和CremorphEL)和穩(wěn)定劑(Oleicacid和VitaminE)中的溶解度。取過量PN置于10mL具塞刻度試管中,分別加入各種油、表面活性劑和穩(wěn)定劑5mL,密封,避光,渦旋混勻,于(25±1)℃、150r·min-1恒溫水浴中機械震蕩72h。達到平衡后,4000r·min-1離心10min,取部分上清液用0.45μm微孔濾膜保溫過濾。取續(xù)濾液,用流動相適當稀釋,HPLC檢測藥物濃度,即得PN的表觀溶解度。同法操作3次,取平均值。CS-PN/SE的制備將處方量的MCT(5%,w/v),Tween80(4%),Span80(1%),油酸(0.88%),PN(1%)研磨混合均勻,預熱到40℃作為油相;另將處方量的甘油(2.2%)和去離子水預熱到40℃作為水相。將水相緩慢加入油相中,6000r·min-1高速剪切6min制得PN/SE。按照一定體積比,在(25±1)℃和磁力攪拌(300r·min-1)下,將CS的醋酸溶液緩慢滴加至PN/SE中,滴加完畢后持續(xù)攪拌30min,然后用0.5mol·L-1NaOH調節(jié)pH至5.0~5.5,得到CS-PN/SE,2~6℃放置備用。CS-PN/SE的優(yōu)化根據單因素實驗結果,采用3因素、3水平的星點設計-效應面法優(yōu)化處方。各因素的取值范圍分別為:Span80濃度(X1,0~2%)、油酸濃度(X2,0.26%~1.5%)以及CS濃度(X3,0.25%~1.0%),各因素和水平見表1。以平均粒徑、多分散系數(PI)、電位、包封率作為因變量(效應),用DesignExpert7.0軟件將效應與因素進行模型擬合,描繪等高線圖,從效應的較優(yōu)區(qū)讀取優(yōu)化處方范圍,并對其進行實驗驗證。PN包封率測定采用超濾法測定PN/SE和CS-PN/SE的包封率(encapsulationefficiency,EE%),取制劑0.5mL至超濾離心管(分子截留量10kD)中,4000r·min-1離心15min,收集3個離心套管的上清液至1mL量瓶中,加入內標(90μg·mL-1苯甲酸)200μL,用流動相定容,HPLC檢測,經換算得游離藥物濃度C1。按照含量測定方法測得制劑中總的藥物濃度C0。包封率可按下式計算:EE%=(C0-C1)/C0×100%。PN/SE和CS-PN/SE的質量評價采用馬爾文激光粒度測定儀測定PN/SE和CS-PN/SE的粒徑和zeta電位。采用磷鎢酸(1%,w/v)負染法,通過透射電子顯微鏡觀察PN/SE外層包覆CS前后粒徑和形態(tài)的變化。眼表滯留性研究PNs(1%,w/v)、PN/SE(1%)和CS-PN/SE(1%)3組制劑隨機分配家兔,每組制劑各時間點均包括3只兔眼的數據。分別于家兔結膜囊內給予上述制劑各50μL,輕輕閉合10s。給藥5、10、15、20、25、30、45、60、75、90、120、150和180min后,用毛細管在角結膜囊內吸取淚液約2μL,凍存待測。縮瞳藥效學研究PNs(1%,w/v)、PN/SE(1%)和CS-PN/SE(1%)3組制劑隨機分配家兔,每組制劑各時間點均包括3只兔眼的數據。給藥前用瞳孔尺記錄左右眼瞳孔的直徑,記作基礎值d0,分別于結膜囊內給予上述制劑50μL,輕輕閉合10s。在給藥后2.5、5、10、15、20、25、30、45、60、90、120、180、240、300、360、420和480min,記錄瞳孔直徑,記為dt。3組制劑各時間點的縮瞳率可按下式計算:縮瞳率=(d0-dt)/d0×100%,并繪制縮瞳率-時間藥效曲線。眼刺激性實驗取新西蘭白兔隨機分成3組,每組3只。各組左眼均給予生理鹽水50μL作為對照,右眼分別給予PNs(1%,w/v)、PN/SE(1%)和CS-PN/SE(1%)50μL。給藥后2、12、24、48和72h記錄眼部是否出現眼瞼痙攣,結膜充血、水腫、流淚和分泌物增多等刺激癥狀,以及口角流涎的全身副反應。根據Draize評分標準,將角膜、虹膜和結膜的刺激性分數累加作為每只兔的眼部刺激分值。統計學處理用t檢驗對各藥動學參數進行統計學分析。結果1水分配系數及親水性和親水性采用搖瓶-紫外分光光度法測得硝酸毛果蕓香堿的油水分配系數LogP為-0.296,表明藥物親水性好,脂溶性差,可以預測藥物在脂溶性的眼表黏膜中滲透性不高。2油相、乳化劑和穩(wěn)定劑的選擇考察了硝酸毛果蕓香堿在水、不同油、表面活性劑和穩(wěn)定劑中的表觀溶解度,結果見表2。硝酸毛果蕓香堿在水中易溶,溶解度約為123.7mg·mL-1,而在油相中的溶解性差。然而溶解于油相中的藥物由于脂溶性增加,易于透過脂溶性的眼表黏膜被吸收,故需選擇對藥物溶解能力大的油相、表面活性劑和穩(wěn)定劑,并能以較少的表面活性劑用量制得藥物包封率高、穩(wěn)定性好的亞微乳。相對大豆油和蓖麻油而言,MCT親水性好,硝酸毛果蕓香堿在其中的溶解度較大,故選擇其作為油相。Tween80具有良好的安全性和乳化性能,對硝酸毛果蕓香堿的溶解能力相對強些,故選其作為乳化劑。雖然硝酸毛果蕓香堿在Span80中的溶解度小,但Span80與Tween80相容性好,且能提高乳劑的穩(wěn)定性,故選擇Span80為助乳化劑。此外預實驗結果表明,油酸能與毛果蕓香堿形成脂溶性復合物,有效阻止其從油相中遷移至水相中,提高藥物在油相中的分布,故選擇油酸作為穩(wěn)定劑。3配方的確定及驗證星點設計各水平實驗結果見表3,表中OD(overalldesirability,OD)值是將每個指標按歸一化法標準化為0~1之間的“歸一值”,各指標的“歸一值”求算幾何平均得總評“歸一值”,具體求算方法見參考文獻。采用Design-Expert7.0軟件對各水平進行多元非線性回歸,得到如下二項式:由上式可以看出Span80、油酸和CS濃度均會影響總評“歸一值”(OD),且3因素之間還存在相互作用。為確定處方的最優(yōu)取值區(qū)域,根據上述方程應用Design-Expert7.0描繪OD值的等高線圖(圖1~3)。綜合考慮OD值的等高線圖及制劑制備的實際情況,選定較優(yōu)處方為:Span80(X1,0.45%)、油酸(X2,1.40%)和CS(X3,0.75%)。按照優(yōu)化處方對各效應值進行考察,重復3次,并對預測結果進行驗證,結果見表4。結果顯示,實測值與預測值間偏差較小,表明模型預測性良好,優(yōu)化結果具有較高的可靠性。4cs的染色PN/SE和CS-PN/SE的透射電鏡照片見圖4。結果表明,PN/SE呈球形,圓整性好,平均粒徑在100nm左右,與粒度儀測得結果基本一致(圖4A)。PN/SE與CS孵育后,CS可包覆在乳滴表面,乳滴由圓整變成不規(guī)則狀,粒徑增大,染色效果發(fā)生改變。PN/SE經磷鎢酸染色后乳滴呈黑色,即正染效果(原因可能是乳滴中Span80對磷鎢酸具有較強吸附作用增強了電子的散射),而處方中CS濃度為0.75%的CS-PN/SE在染色后仍呈現正染效果,但是乳滴外周和中心出現了負染效果(乳滴被部分染成白色,圖4B)。為進一步證實CS能包覆在乳滴表面,將處方中CS的濃度提高至1.2%(w/v),采用透射電鏡進行表征,結果發(fā)現,經磷鎢酸染色后呈現負染效果,乳滴呈白色(圖4C)。出現這種現象的原因可能是CS能包覆在大部分乳滴表面,阻礙PN/SE中Span80對磷鎢酸的吸附,減少電子的散射,表現出負染效果。比較PN/SE和CS-PN/SE的TEM圖發(fā)現,經CS包覆后乳滴粒徑、外觀形態(tài)以及染色效果均發(fā)生改變,且改變的程度與CS濃度呈正相關。5藥物殘留時間眼表滯留經時曲線(圖5)結果顯示,由于眨眼和淚液清除作用,藥物在眼表的消除符合一級動力學特征。市售PNs給藥后被迅速消除(KPNs為0.0135±0.0004min-1),給藥后75min家兔淚液中藥物質量濃度約為20μg·mL-1,而此后時間點下淚液中藥物濃度已低于檢測限,藥物在眼表的平均滯留時間(MRT)約為74.4min;與PNs相比,PN/SE的眼部消除減慢,眼表滯留時間延長,其消除速率常數(KPN/SE)為0.0094±0.0004min-1,MRT約為107.1min。相對PNs和PN/SE而言,CS-PN/SE組的清除速率顯著降低,KCS-PN/SE為0.0064±0.0003min-1,平均駐留時間MRT(155.4min)明顯延長,約為PNs組的2.1倍,PN/SE組的1.5倍。CS-PN/SE組給藥后180min仍能檢測到眼表滯留的藥物,長于PNs和PN/SE組的75min和150min;給藥20min后CS-PN/SE組滯留在眼表的藥物濃度均高于參比組,且均存在顯著性差異(P<0.05)。上述結果表明,CS-PN/SE能顯著地減緩藥物眼表清除速率,延長藥物在眼表的滯留時間。6縮瞳藥效持續(xù)時間各制劑的縮瞳藥效經時曲線見圖6,表5的主要藥效學參數由對數梯形法計算得到。參比組PNs和PN/SE在給藥后20min,達到最大縮瞳率分別為36.7%和38.7%,縮瞳藥效持續(xù)的時間分別為225min和375min。由于角膜滯留和增加角膜滲透作用,CS-PN/SE組的最大縮瞳率(46.3%)約為參比組的1.2倍,且給藥15min后縮瞳率均高于參比組,縮瞳藥效持續(xù)時間明顯延長(480min),縮瞳率-時間曲線下面積AUC提高,為PNs組和PN/SE組的1.6倍和1.2倍(表5)。以上結果表明,CS-PN/SE能促進藥物的跨角結膜吸收,延長縮瞳藥效持續(xù)時間,提高藥物的眼部生物利用度,可實現減少給藥頻次的目的。7口角流腥的防治各制劑組在各時間點均未出現兔眼瞼痙攣,結膜充血、水腫、流淚及分泌物增多等刺激癥狀,也未出現口角流涎的全身副反應。兔眼部刺激性結果見表6。結果顯示,CS-PN/SE單次眼部給藥,其角膜、虹膜和結膜組織均無明顯變化,根據刺激性評價標準可判斷CS/PN-NE無刺激性。cs的透皮吸收pn藥物硝酸毛果蕓香堿是治療原發(fā)性閉角型青光眼的主要藥物,其普通溶液劑易被結膜囊內的淚液稀釋并從淚道排走,因此制劑與眼表的接觸時間較短,為了維持有效藥物濃度,需要增加滴眼頻次,但同時藥物的副反應增加,還帶來患者順應性的問題。本研究制備了具有黏膜黏附性的亞微乳,并重點評價了CS-PN/SE的眼表滯留特性和縮瞳藥效作用。眼表黏膜層(如角膜、結膜)是藥物吸收的主要屏障,提高眼用制劑的眼部生物利用度的主要途徑有:增加藥物在眼表黏膜層中的滲透力和延長藥物眼表滯留時間。CS-PN/SE采用O/W型亞微乳載體,借助制劑學手段將PN包裹在油相中,改善了PN的脂溶性,進一步提高PN在角膜層中的滲透性,有助于其進入虹膜和睫狀肌等作用部位,且滯留在角結膜囊內的亞微乳可作為