甌柑莖尖分生組織的微芽嫁接脫毒效果研究

甌柑莖尖分生組織的微芽嫁接脫毒效果研究

茴香是浙江省溫州獨(dú)特的抗貯藏性優(yōu)良品種，貯藏時(shí)間超過250天。然而，由于柑橘黃龍病的破壞，蓮花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展非常困難。歐美各國早在20世紀(jì)世紀(jì)80年代,就開始系統(tǒng)地研究各類果樹的脫毒技術(shù)和病毒檢測(cè)方法,獲得了一大批無病毒苗木。20世紀(jì)90年代以來,又著重開展了果樹良種繁育體系的建立,推行果樹無病毒化栽培。20世紀(jì)90年代美國柑橘增產(chǎn)五成,一個(gè)重要的原因是定植無病毒苗木。隨著國際國內(nèi)柑橘市場(chǎng)的變化,許多優(yōu)良地方品種和引進(jìn)的優(yōu)良品種需要擴(kuò)大繁殖,但通常從STG脫毒到提供健康接穗需要1.5～2a的時(shí)間,莖尖微芽嫁接緩苗期長(zhǎng),生長(zhǎng)慢的問題制約了新品種的推廣和應(yīng)用。采用莖尖微芽嫁接脫除黃龍病病原已證明是獲得無病毒苗木的有效方法,所取莖尖的大小對(duì)脫毒效果和嫁接成活率有著明顯的影響。針對(duì)黃龍病脫毒技術(shù)并沒有相關(guān)的詳細(xì)資料可尋。本試驗(yàn)旨在利用PCR分子檢測(cè)手段,分析確定莖尖微芽嫁接時(shí),脫除柑橘黃龍病所需的最適莖尖大小,從而協(xié)調(diào)好提高脫毒率與提高嫁接成活率之間的矛盾。同時(shí),為了加快無病毒苗生長(zhǎng)速度,滿足市場(chǎng)規(guī)?；a(chǎn)的需要,本課題就加速試管苗生長(zhǎng)技術(shù)進(jìn)行了研究。1材料和方法1.1葉片的制備從浙江省麗水市林業(yè)科學(xué)研究所提供的2a生甌柑苗木上,采得葉片樣品,經(jīng)液氮處理后,貯存在-70℃超低溫冰箱中。從福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院采集接種了經(jīng)鑒定的黃龍病病原,并表現(xiàn)出黃化斑駁癥狀的長(zhǎng)春花葉片作陽性對(duì)照。1.2常規(guī)消毒處理冰糖橙(C.sinensisOsbeck)作過渡性砧木。取新鮮種子經(jīng)去果膠處理后,移到超凈工作臺(tái)上,進(jìn)行常規(guī)消毒處理。去種皮后,將種子接種到MT培養(yǎng)基中,在(26±1)℃,暗培養(yǎng)2周,獲得黃化苗用作嫁接砧木。1.3葉原基大小對(duì)微芽嫁接當(dāng)新梢長(zhǎng)至1～2cm時(shí),采嫩芽作接穗。表面消毒后,在雙目實(shí)體顯微鏡下,剝?nèi)『猩L(zhǎng)錐及1、2、3、4個(gè)葉原基的不同大小的莖尖分別進(jìn)行微芽嫁接,嫁接操作根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行。每種大小的莖尖嫁接60個(gè),分多次進(jìn)行,嫁接速度為20～25芽/h,每次約需1h。嫁接成活后,及時(shí)除萌,待試管苗長(zhǎng)出真葉,葉片長(zhǎng)約2cm時(shí),將試管苗移入無菌培養(yǎng)土中。待試管苗長(zhǎng)出4～6片葉時(shí),取樣作黃龍病病原檢測(cè)。1.4pcr擴(kuò)增試驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)提取脫毒前后樣品及對(duì)照樣品中的DNA,在Ultrospec2100proUV/VisibleSpectrophotometer上測(cè)定DNA濃度,并將其濃度稀釋為500ng/μL,待PCR檢測(cè)用。根據(jù)VILLECHAMOUX等的報(bào)道,設(shè)計(jì)黃龍病亞州株系特異性引物,用于PCR試驗(yàn)。引物由上海生工生物技術(shù)公司合成,引物序列為:①(+)5′-TGAATTCTTCGAGGTTGGTGAGC-3′;②(-)5′-AGAATTCGACTTAATCCCCACCT-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-100PeltierThermalCycler(MJResearch)熱循環(huán)儀中進(jìn)行。采用TaKaRaPCRKit進(jìn)行PCR反應(yīng),參考說明書中基本操作進(jìn)行試驗(yàn)。經(jīng)試驗(yàn)采用的最佳擴(kuò)增條件為:94℃開始變性5min,接著,94℃變性30s,56℃退火30s,72℃延伸1min,進(jìn)行33個(gè)循環(huán),72℃再延伸7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠(Mersco),在70V電壓下電泳50min,溴乙淀染色,然后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。1.5試苗的制作準(zhǔn)備生長(zhǎng)健壯的枳橙砧木,砧木離地10cm處干莖約為0.8～1.2cm為宜。在離地面10～20cm處剪去上部枝梢,在垂直方向切一長(zhǎng)度為1.5cm的切口。當(dāng)試管苗移栽成活,生長(zhǎng)2個(gè)月時(shí),用鋒利的手術(shù)刀將試管苗砧木處削成契形,切面長(zhǎng)約1.5cm,將試管苗靠一邊形成層對(duì)齊,用塑料帶梆緊,用塑料袋將嫁接口以上部分套袋,保濕。以上操作在氣溫為25～30℃條件下進(jìn)行。2結(jié)果與分析2.1嫁接成活率對(duì)莖尖葉原基的影響利用帶有明顯黃化斑駁癥狀的母本植株進(jìn)行莖尖嫁接試驗(yàn),結(jié)果表明:莖尖大小對(duì)莖尖微芽嫁接的成活率有明顯的影響。當(dāng)莖尖含1個(gè)葉原基時(shí),成活率最低,為11.1%,當(dāng)莖尖含2個(gè)葉原基時(shí),成活率為47.7%,莖尖含3個(gè)和4個(gè)葉原基時(shí),嫁接成活率分別為62.2%和78.8%(表1)。觀察發(fā)現(xiàn),嫁接后1周,很容易判斷砧穗是否愈合,如果沒有成活,莖尖會(huì)變成褐色或枯萎的點(diǎn)狀物,應(yīng)立刻去除。如果不去除,因傷口刺激嫁接口很容易產(chǎn)生萌蘗,當(dāng)苗繼續(xù)生長(zhǎng)時(shí),難以辨別是真正的接穗愈合還是萌蘗產(chǎn)生。有少數(shù)情況是莖尖既不枯萎也不繼續(xù)生長(zhǎng),這種類型的試管苗到3～4周時(shí),芽如果還不能迅速抽出,就沒有利用價(jià)值。據(jù)觀察,嫁接成活1～2周時(shí),莖尖葉原基的多少與試管苗的葉子數(shù)是相符合的(圖1)。當(dāng)生成錐繼續(xù)生成2～3周時(shí),中心也會(huì)形成新的小嫩葉。方差分析結(jié)果表明:4種情況下的嫁接成活率均存在著顯著差異,而含1和2個(gè)葉原基與含4個(gè)葉原基的脫毒率差異極顯著(P<0.01),與含3個(gè)葉原基的脫毒率比較差異不顯著(表1)。2.2葉原基嫁接檢測(cè)對(duì)不同大小莖尖微芽嫁接成活的試管苗進(jìn)行黃龍病PCR檢測(cè),結(jié)果表明:當(dāng)莖尖含有1個(gè)葉原基和2個(gè)葉原基時(shí),全部被檢測(cè)樣品均未擴(kuò)增出黃龍病特異性片段,而陽性對(duì)照和甌柑母本植株可以擴(kuò)增出特征片段,用2%的凝膠電泳,在凝膠成像系統(tǒng)中可以觀察到約535bp長(zhǎng)的帶。莖尖含有3個(gè)葉原基嫁接獲得的樣品,可以檢出4.3%的帶毒率,莖尖含有4個(gè)葉原基嫁接獲得的樣品,可以檢出27%的帶毒率(見表1和圖2),由此可見,隨著莖尖的增大,帶病毒的機(jī)率是增加的。在進(jìn)行STG脫除黃龍病的工作時(shí),在熟練的嫁接操作條件下,含有2個(gè)葉原基的莖尖嫁接成活率為47.7%,但能完全將病毒脫掉,當(dāng)莖尖更大時(shí),盡管莖尖嫁接成活率明顯提高,但不能完全徹底地脫除病毒。由此可見,剝?nèi)∵m宜大小的莖尖分生組織用于STG是保證良好的脫毒效果的關(guān)鍵。2.3莖尖嫁接苗移栽后,其嫁接后的生長(zhǎng)情況檢測(cè),結(jié)果見表1二次嫁接試驗(yàn)表明,莖尖微芽嫁接苗移栽2個(gè)月時(shí),試管苗總長(zhǎng)度平均為16cm(圖3-a),可用作接穗進(jìn)行二次嫁接,嫁接時(shí),在過渡砧木上切成契型斜面,其面積比直接在接穗上切的面積大,以便于愈合。由于接穗上保留了葉片,用套袋的方法保濕,嫁接后約10d即可愈合,葉片可以進(jìn)行光合作用,快速恢復(fù)生長(zhǎng)。本試驗(yàn)二次嫁接了35株STG苗,早上7:00～9:00在網(wǎng)室中進(jìn)行,操作分3次完成,成活32株,培養(yǎng)12個(gè)月時(shí),莖尖微芽嫁接接口以上枝梢長(zhǎng)度平均為27.1cm,32株對(duì)照植株的枝梢長(zhǎng)度平均為19.1cm,小樣本平均數(shù)差異測(cè)驗(yàn)(t測(cè)驗(yàn))表明,甌柑二次嫁接與莖尖嫁接苗直接移栽比較,其接穗長(zhǎng)度差異非常顯著。圖3-b為二次嫁接10d時(shí)發(fā)出新芽,圖3-c顯示,從STG開始12個(gè)月時(shí),二次嫁接苗比STG苗生長(zhǎng)速度加快。3莖尖微芽嫁接脫毒試驗(yàn)NAVARRO等指出,0.14～0.16mm的莖尖能有效地脫掉病毒。對(duì)柑橘甜橙、溫州蜜柑品種進(jìn)行脫毒時(shí),不能照搬前人的做法,因?yàn)楹嗤瑪?shù)目的葉原基的柚類的莖尖比甜橙和溫州蜜柑的莖尖大2～3倍,有時(shí)需要將莖尖進(jìn)行切分,保留生長(zhǎng)錐和1到2個(gè)葉原基用于微芽嫁接。在單純用莖尖培養(yǎng)或莖尖嫁接難以完全脫毒時(shí),可以考慮用莖尖培養(yǎng)與熱處理或莖尖培養(yǎng)與化學(xué)處理的方法以結(jié)合,以達(dá)到理想的脫毒效果。但不能排除上述方法照成的負(fù)面影響。本試驗(yàn)進(jìn)一步說明,應(yīng)該在保證理想的脫毒率的前提下,注意獲得盡可能高的成活率。本試驗(yàn)證明以切取含有生長(zhǎng)錐和2個(gè)葉原基的莖尖分生組織用于STG操作是達(dá)到理想的黃龍病脫毒效果的最佳選擇。