基于hplc指紋圖譜的半夏及其炮制品姜半夏不同提取部位的藥效研究

基于hplc指紋圖譜的半夏及其炮制品姜半夏不同提取部位的藥效研究

半夏天南星科植物（pr）是半夏屬植物的干燥區(qū)域，主要產于四川、山東、河南、陜西、云南、貴州等省。半夏為中醫(yī)臨床常用中藥,其性辛、溫,具有燥濕化痰、消痞散結之功。因其味辛辣、麻舌刺喉,具有“戟人咽”的刺激性,故生半夏一般不內服,臨床炮制后應用。姜半夏PinelliaeRhizomaPraeparatumcumZingibereetAlumine(PRPZA)為《中國藥典》2010年版收載的半夏炮制品,由生姜煎湯,加白礬與半夏共煮而成,具有溫中化痰、降逆止嘔的功效,多用于痰飲嘔吐等。半夏成分復雜,主要含核苷類、生物堿、有機酸、蛋白、氨基酸、多糖、揮發(fā)油等,目前報道的與半夏藥效、質量相關的成分主要有核苷類、生物堿類和有機酸類。半夏經姜制成姜半夏,增加了止嘔的功效,與炮制過程中加入生姜有關,生姜具有降逆止嘔功效,其主要藥效成分為6-姜辣素。本實驗采用HPLC梯度洗脫法首次建立了半夏及其炮制品姜半夏不同提取部位的HPLC特征指紋圖譜,并對肌苷、鳥苷、腺苷、琥珀酸、鹽酸麻黃堿、6-姜辣素6個特征性成分進行指認,為半夏炮制前后主要物質基礎的改變以及二者的質量控制提供可靠方法和科學依據。1藥品、試劑與儀器KQ—500DB數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Agilenttechnologies1200高效液相色譜儀;Heidolph-Laborota4000旋轉蒸發(fā)儀(德國海道夫公司);AllegraX—22R離心機(美國貝克曼公司);BP121S十萬分之一電子天平(德國賽多利斯公司)。對照品鳥苷(批號86-09-10,質量分數99.8%)、肌苷(批號140669-200401,質量分數99.2%)、腺苷(批號110879-200202,質量分數99.8%)、琥珀酸(批號110896-200202,質量分數99.6%)、鹽酸麻黃堿(批號0714-9903,質量分數99.7%)、6-姜辣素(批號111610-201106,質量分數98.6%),中國食品藥品檢定研究院;乙腈為色譜純;水為超純水;其余試劑均為分析純。生半夏藥材采自全國5個省份;姜半夏飲片8批,其中按《中國藥典》2010年版方法,用生半夏炮制3批,見表1。樣品經成都中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室李敏教授鑒定為天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb.)Berit.的干燥塊莖及其炮制品姜半夏。2方法和結果2.1姜半夏的制備按照《中國藥典》2010年版姜半夏炮制方法進行炮制。2.2%乙腈基苯磺酸酯3.2%AgilentEclipseXDBC18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);以乙腈-水為流動相進行梯度洗脫,洗脫程序:0~10min,0.5%~1.0%乙腈;10~15min,1.0%~1.5%乙腈;15~30min,1.5%~5.5%乙腈;30~35min,5.5%~10.0%乙腈;35~45min,10.0%~15.0%乙腈;45~50min,15.0%~20.0%乙腈;50~57min,20.0%~26.0%乙腈;57~62min,26.0%~33.0%乙腈;62~63min,33.0%~37.0%乙腈;63~77min,37.0%~50.0%乙腈;77~87min,50.0%乙腈;87~92min,50.0%~0.5%乙腈;體積流量1.0mL/min;檢測波長265nm;柱溫30℃;進樣量10μL。2.3對照品溶液的配制核苷對照品溶液的制備:精密稱取鳥苷、肌苷、腺苷對照品各2mg,分別置于10mL量瓶中,加水定容,搖勻,配成0.2mg/mL對照品溶液。琥珀酸、鹽酸麻黃堿、6-姜辣素對照品溶液的制備:精密稱取3種對照品各2mg,置于10mL量瓶中,加甲醇定容,搖勻,配成0.2mg/mL對照品溶液。2.4乙醇法提取添加0.4%的微孔濾膜水提液:分別精密稱取半夏、姜半夏粉末(過60目篩)各0.5g,加水5mL,超聲提取45min,放冷后補足減失的質量,離心,取上清液,經0.45μm微孔濾膜濾過,即得。75%乙醇提取液:分別精密稱取半夏、姜半夏粉末(過60目篩)各0.5g,加75%乙醇5mL,超聲提取45min,放冷后補足減失的質量,濾過,回收乙醇,用甲醇定容至5mL,經0.45μm微孔濾膜濾過,即得。95%乙醇提取液:分別精密稱取半夏、姜半夏粉末(過60目篩)各0.5g,加95%乙醇5mL,超聲提取45min,放冷后補足減失的質量,濾過,回收乙醇,用甲醇定容至5mL,經0.45μm微孔濾膜濾過,即得。2.5儀器精密度試驗2.5.1空白試驗精密吸取甲醇溶液10μL作為空白溶液,注入高效液相色譜儀,按“2.2”項下色譜條件進行測定。結果表明,空白溶液對測定結果無干擾。2.5.2測定時間的確定精密吸取半夏、姜半夏供試品溶液各10μL,注入高效液相色譜儀,按“2.2”項下色譜條件進行測定,87min后,繼續(xù)保持50%乙腈洗脫30min,色譜圖顯示,保留時間92min后無色譜峰,故將時間確定為92min。2.5.3精密度試驗精密吸取同一供試品溶液10μL,連續(xù)進樣6次,檢測指紋圖譜,結果表明各共有峰相對保留時間的RSD在0.09%~1.20%,相對峰面積的RSD在0.72%~1.80%,說明儀器精密度良好。2.5.4穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液10μL,分別在0、3、6、9、12、24h進樣,檢測指紋圖譜,結果表明各色譜峰相對保留時間的RSD在0.08%~0.58%,相對峰面積的RSD在0.64%~2.80%,符合指紋圖譜要求,表明供試品溶液在24h內較穩(wěn)定。2.6巖肉樣品水部位相似度檢測2.6.1半夏藥材HPLC特征指紋圖譜的建立將收集的半夏藥材按供試品溶液的制備方法進行制備,精密吸取供試品溶液各10μL注入高效液相色譜儀,進行測定,記錄92min的色譜圖,梯度平衡10min。由色譜圖可知,鳥苷的色譜峰分離良好,峰形穩(wěn)定,且各樣品中均含有此峰,故將保留時間為16.937min的色譜峰(鳥苷)作為參照峰。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”,對半夏藥材不同提取部位的HPLC特征指紋圖譜進行考察,水及75%、95%乙醇提取部位的指紋圖譜共有峰分別為12、13、16個,其中指認了5個特征峰,分別為肌苷、鳥苷、腺苷、琥珀酸、鹽酸麻黃堿,見圖1~4。與水部位相比,75%乙醇提取部位新增1個峰,為圖3中的12號峰(26.4min);95%乙醇提取部位較水、75%乙醇提取部位,色譜峰增多,說明隨著提取溶劑極性的降低,溶出的化學成分也隨之增加。2.6.2半夏藥材HPLC特征指紋圖譜相似度分析采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”,以半夏藥材不同提取部位的共有模式圖為參照,計算相似度,結果編號bx-1、bx-2、bx-3、bx-4、bx-5、bx-6、bx-7、bx-8、bx-9、bx-10樣品水部位相似度分別為0.996、0.985、0.976、0.909、0.917、0.959、0.992、0.993、0.967、0.956;75%乙醇提取部位相似度分別為0.989、0.967、0.992、0.943、0.965、0.979、0.903、0.923、0.987、0.971;95%乙醇提取部位相似度分別為0.993、0.977、0.977、0.990、0.916、0.945、0.944、0.936、0.959、0.987。半夏藥材不同提取部位(水及75%、95%乙醇提取部位)具有較高的相似度,其值均在0.9以上,但化學成分的量存在一定差異;通過比較半夏水及75%、95%乙醇提取部位的HPLC指紋圖譜共有模式發(fā)現,三者色譜峰數目及保留時間差異不大,見圖2~4。2.6.3姜半夏飲片HPLC特征指紋圖譜的建立姜半夏飲片特征指紋圖譜的測定方法同“2.6.1”項,姜半夏水部位、75%乙醇提取部位的共有峰為12個;95%乙醇提取部位的共有峰為11個,與水、75%乙醇提取部位相比,缺失1個共有峰,為圖5、6中的13號峰(27.9min)。其中指認了6個特征峰,分別為肌苷、鳥苷、腺苷、琥珀酸、鹽酸麻黃堿、6-姜辣素,見圖5~7。2.6.4姜半夏HPLC特征指紋圖譜相似度分析按照“2.6.2”方法計算相似度,結果編號jbx-1、jbx-2、jbx-3、jbx-4、jbx-5、jbx-6、jbx-7、jbx-8樣品水部位相似度分別為0.954、0.921、0.919、0.937、0.992、0.906、0.928、0.917;75%乙醇提取部位相似度分別為0.996、0.983、0.943、0.942、0.982、0.994、0.994、0.969;95%乙醇提取部位相似度分別為0.991、0.982、0.967、0.962、0.959、0.977、0.986、0.990。結合圖5~7可看出,各不同提取部位的姜半夏飲片HPLC指紋圖譜相似度較高,且共有峰相對保留時間的RSD均在3.0%以下,僅色譜峰峰面積有所變化。2.6.5半夏藥材與炮制品姜半夏HPLC特征指紋圖譜比較本實驗對半夏及其炮制品姜半夏不同提取部位的HPLC特征指紋圖譜進行了比較,結果發(fā)現二者指紋圖譜中色譜峰的數目與峰面積不同,且圖譜間差異大,相似度低,僅為0.219~0.774,結果見表2。從兩者的水部位(圖2、5)中可看出,炮制品姜半夏與生半夏相比,新增2個峰,分別為圖5中的10號峰(18.3min)、19號峰(6-姜辣素,73.5min);缺失2個峰,分別為圖2中的11號峰(23.8min)、14號峰(33.9min)。在75%乙醇提取部位(圖3、6)指紋圖譜中,姜半夏與半夏相比,新增2個峰,分別為圖6中的10號峰(18.3min)、19號峰(6-姜辣素,73.5min);缺失3個峰,分別為圖3中的11號峰(23.8min)、12號峰(26.4min)、14號峰(33.9min)。在95%乙醇提取部位指紋圖譜(圖4、7)中,姜半夏與半夏相比,新增2個峰,為圖7中的10號峰(18.3min)、19號峰(6-姜辣素,73.5min);缺失7個峰,分別為圖4中的6號峰(14.1min)、7號峰(15.3min)、11號峰(23.8min)、12號峰(26.4min)、13號峰(腺苷,27.9min)、17號峰(52.8min)和18號峰(66.8min)。半夏與其炮制品姜半夏不同提取部位的HPLC特征指紋圖譜除色譜峰數目不同外,峰面積也不同,整體隨著提取溶劑極性的降低而減少,95%乙醇提取部位下降最為顯著,這充分說明半夏姜制后,化學成分在質和量上發(fā)生了明顯的變化。2.6.6主成分分析(PCA)對半夏、姜半夏不同溶劑提取部位的HPLC特征指紋圖譜保留時間(tR)以及與tR對應的相關峰面積進行PCA,結果見表3。前4個主成分的累積貢獻率為79.95%,主成分1為36.6%,其特征向量載荷較高同時符號為正的tR有:9.1、11.8、20.0、23.1min以及tR為7.7、9.1、23.1min的相關峰面積;主成分2為23.78%,其特征向量載荷較高同時符號為正的tR有:11.0、18.3、23.5、33.4、73.6min以及tR為5.5、6.3、7.7、18.3min的相關峰面積;主成分3為11.32%,其特征向量載荷較高同時符號為正的tR有:23.5、33.4、52.7min以及tR為20.0、23.5、52.7min的相關峰面積;主成分4為8.25%,其特征向量載荷較高同時符號為正的tR有:6.3、7.7、17.0min以及tR為6.3、33.4min的相關峰面積。根據半夏及其姜半夏不同提取部位HPLC指紋圖譜的tR以及與tR對應的相關峰面積得到PCA二維載荷圖和3D得分圖,見圖8、9。從圖中可以看出,PCA能夠很好地將不同類別樣品區(qū)分開來。3討論3.1指紋圖譜的建立本實驗對提取溶劑、色譜柱、流動相和檢測波長進行了考察,經研究發(fā)現,相同色譜條件下,不同提取溶劑:水,75%、95%乙醇,甲醇和醋酸乙酯,以水及75%、95%乙醇為提取溶劑得到的色譜峰數目較多,且分離度良好;AgilentEclipseXDBC18分離度優(yōu)于WaterssymmetryC18;分別對乙腈-水、乙腈-0.02%磷酸水溶液和甲醇-水3種流動相系統(tǒng)進行了考察,結果表明乙腈-水的指紋圖譜色譜峰較多且分離效果較好;通過比較8個波長下的HPLC特征指紋圖譜,發(fā)現在265nm下色譜峰數目多,且強度及分離度好。在本實驗建立的色譜條件下,半夏及姜半夏不同提取部位中的化學成分分離度良好,圖譜清晰,方法重復性好、精密度高,可系統(tǒng)、有效地控制半夏藥材及姜半夏飲片的質量。3.2姜夏峰分離度的