酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交

酵母雙雜交

是在真核模式生物酵母中進(jìn)行的，研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測(cè)得到，它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程的認(rèn)識(shí)。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交

反式轉(zhuǎn)錄激活因子

結(jié)構(gòu)上是組件式的，即這些因子往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain，簡(jiǎn)稱為BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain，簡(jiǎn)稱為AD)。

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這兩個(gè)結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_(kāi)時(shí)仍分別具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開(kāi)的兩者通過(guò)適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí)，才能重新呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstreamactivatingsequence,UAS）的下游啟動(dòng)子，使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。

酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交酵母雙雜交酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交酵母雙雜交系統(tǒng)的另一個(gè)重要的元件

報(bào)道株指經(jīng)改造的、含報(bào)道基因(reportergene)的重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。

最常用的是酵母細(xì)胞，酵母細(xì)胞作為報(bào)道株具有許多優(yōu)點(diǎn):

〈1〉易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒。

〈2〉具有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報(bào)道基因。

〈3〉酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來(lái)源于哺乳動(dòng)物的蛋白結(jié)合酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交根據(jù)這個(gè)特性，將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)Baitprotein的基因構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)載體上，在酵母中表達(dá)兩者的BD-Baitprotein融合蛋白。將編碼AD的基因和cDNA文庫(kù)的基因構(gòu)建在

AD-LIBRARY表達(dá)載體上,在酵母中表達(dá)兩者的融合蛋白。酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交如果誘餌蛋白和靶蛋白能夠相互作用，那么GAL4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和GAL4激活結(jié)構(gòu)域就會(huì)相互作用，從而激活lacZ報(bào)道基因的表達(dá)。所以我們可以通過(guò)轉(zhuǎn)化的酵母的表型來(lái)確定誘餌蛋白和靶蛋白是否有相互作用。

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酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交這種改造后的酵母細(xì)胞的基因組中既不能產(chǎn)生GAL4，又不能合成ADE、HIS、LEU、TRP，因此，酵母在缺乏這些營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基上無(wú)法正常生長(zhǎng)。當(dāng)上述兩種載體所表達(dá)的融合蛋白能夠相互作用時(shí)，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報(bào)告基因ADE、HIS、LACZ、MEL1，從而通過(guò)功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽(yáng)性菌落。將陽(yáng)性反應(yīng)的酵母菌株中的AD-LIBRARY載體提取分離出來(lái)，從而對(duì)載體中插入的文庫(kù)基因進(jìn)行測(cè)序和分析工作。

酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交綜上：酵母雙雜交系統(tǒng)通過(guò)兩個(gè)雜交蛋白在酵母細(xì)胞中的相互結(jié)合及對(duì)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄激活來(lái)捕獲新的蛋白質(zhì)，其大致步驟為:

1、視已知蛋白的cDNA序列為誘餌(bait)，將其與DNA結(jié)合域融合，構(gòu)建成誘餌質(zhì)粒。

2、將待篩選蛋白的cDNA序列與轉(zhuǎn)錄激活域融合，構(gòu)建成文庫(kù)質(zhì)粒。酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交3、將這兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化于酵母細(xì)胞中。4、酵母細(xì)胞中，已分離的DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域不會(huì)相互作用，但誘餌蛋白若能與待篩選的未知蛋白特異性地相互作用，則可激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄；反之，則不能。利用4種報(bào)告基因的表達(dá)，便可捕捉到新的蛋白質(zhì)。酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交

酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用1、利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能當(dāng)我們將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫(kù)中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽(yáng)性酵母菌株中可以分離得到AD-LIBRARY載體，并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的cDNA片段，并對(duì)該片段的編碼序列在GENEBANK中進(jìn)行比較，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。另外，也可作為研究已知基因的新功能或多個(gè)篩選到的已知基因之間功能相關(guān)的主要方法。酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交

2、利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用

利用酶聯(lián)免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技術(shù)都是利用抗原和抗體間的免疫反應(yīng)，可以研究抗原和抗體之間的相互作用，但是，它們都是基于體外非細(xì)胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。而在細(xì)胞體內(nèi)的抗原和抗體的聚積反應(yīng)則可以通過(guò)酵母雙雜交進(jìn)行檢測(cè)。

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3、利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥物對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用的影響

酵母雙雜交的報(bào)告基因能否表達(dá)在于誘餌蛋白與靶蛋白之間的相互作用。對(duì)于能夠引發(fā)疾病反應(yīng)的蛋白互作可以采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達(dá)到治療疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黃熱病、肝炎等疾病，研究發(fā)現(xiàn)它的病毒RNA復(fù)制與依賴于RNA的RNA聚合酶（NS5）與拓?fù)洚悩?gòu)酶NS3，以及細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)受體BETA-importin的相互作用有關(guān)。研究人員通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)找到了這些蛋白之間相互作用的氨基酸序列。如果能找到相應(yīng)的基因藥物阻斷這些蛋白之間的相互作用，就可以阻止RNA病毒的復(fù)制，從而達(dá)到治療這種疾病的目的。

酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交4、利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖

眾多的蛋白質(zhì)之間在許多重要的生命活動(dòng)中都是彼此協(xié)調(diào)和控制的。基因組中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過(guò)基因組的測(cè)序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母雙雜交技術(shù)，將所有已知基因和EST序列為誘餌，在表達(dá)文庫(kù)中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。對(duì)于認(rèn)識(shí)一些重要的生命活動(dòng)：如信號(hào)傳導(dǎo)、代謝途徑等有重要意義酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交

在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上，又發(fā)展出了

酵母單雜交、酵母三雜交和酵母的反向雜交技術(shù)。它們被分別用于核酸和文庫(kù)蛋白之間的研究、三種不同蛋白之間的互作研究和兩種蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)和位點(diǎn)。酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交

酵母單雜交技術(shù)最早是從酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展而來(lái)，酵母雙雜交技術(shù)通過(guò)對(duì)報(bào)告基因的表型進(jìn)行檢測(cè)以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)間相互作用的研究，而酵母單雜交技術(shù)則通過(guò)對(duì)報(bào)告基因的表型檢測(cè)，分析DNA、蛋白之間的相互作用，以研究真核細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控。酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交

原理用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白即是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子。研究表明GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端，含有幾個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(diǎn)(UAS)；而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過(guò)程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨(dú)立地發(fā)揮作用。據(jù)此，我們可將GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域置換為其他蛋白，只要他能與我們想要了解的目的基因相互作用，就照樣可以通過(guò)其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活RNA聚合酶，從而啟動(dòng)對(duì)下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交

正是基于這一理論，酵母單雜交系統(tǒng)由2部分組成：(1)將文庫(kù)蛋白片段與GAL4轉(zhuǎn)錄激活域融合表達(dá)的cDNA文庫(kù)質(zhì)粒；(2)含有目的基因和下游報(bào)告基因的報(bào)告質(zhì)粒.

首先將報(bào)告質(zhì)粒整合入酵母基因組,產(chǎn)生帶有目的基因的酵母報(bào)告株;

再將文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入報(bào)告株;

若存在文庫(kù)蛋白與目的基因的相互作用,可通過(guò)對(duì)報(bào)告基因的表達(dá)將文庫(kù)蛋白的基因篩選出來(lái).酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交

酵母三雜交系統(tǒng)的原理與酵母雙雜交相似，利用了酵母細(xì)胞的GAL4蛋白調(diào)節(jié)目的基因(半乳糖苷酶基因及His3基因)轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)。GAL4蛋白具有兩個(gè)可分離的功能區(qū)，N端是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，C端為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。只要這兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域能夠通過(guò)一定的方式在空間上足夠的靠近(如借助其他分子的相互結(jié)合使其足夠靠近)，即使它們之間沒(méi)有共價(jià)結(jié)合也可激活轉(zhuǎn)錄，這為研究蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用提供了可能。酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交

酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交

上圖顯示了酵母三雜交系統(tǒng)的原理。在酵母三雜交系統(tǒng)，lexA啟動(dòng)子調(diào)控下游LacZ基因和His3基因的表達(dá)，而lexA啟動(dòng)子的激活取決于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域能否在空間上相互靠近。其中第一個(gè)融合蛋白由兩部分組成，一部分為能結(jié)合lexA啟動(dòng)子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，另一部分為噬菌體衣殼蛋白MS2。第二個(gè)融合蛋白也由兩部分組成，一部分為能激活lexA啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，另一部分為有待研究的RNA結(jié)合蛋白“Y”。酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交

這兩個(gè)融合蛋白通過(guò)第三個(gè)融合的RNA分子相連，其一端為含有噬菌體衣殼蛋白MS2結(jié)合位點(diǎn)的MS2RNA，另一端為有待研究的RNA“X”。一旦“X”和“Y”能有相互作用就使得這個(gè)復(fù)合物形成一個(gè)功能性的轉(zhuǎn)錄激活因子，從而使得下游的LacZ基因和His3基因得以表達(dá)。LacZ基因的表達(dá)水平能夠通過(guò)在體外檢測(cè)β