il-1、il-6及nf-在慢性前腦缺血致血管性癡呆發(fā)病機制中的表達

il-1、il-6及nf-在慢性前腦缺血致血管性癡呆發(fā)病機制中的表達

血管性腦癱（vd）是老年人的重要疾病。以往認為血管性癡呆是腦梗死所致。近年來臨床研究發(fā)現(xiàn):慢性腦灌注不足尤其是皮質下白質腦血流量慢性持續(xù)性下降可能是導致血管性癡呆的主要原因之一,故慢性缺血在VD發(fā)病機制中所起的作用開始引起人們關注。在前期工作中,我們采用雙側頸總動脈永久結扎方法成功制備了慢性前腦缺血動物模型,應用激光多普勒血流儀檢測了各組大鼠術后不同時間點額葉、頂葉、海馬及皮質下區(qū)局部腦血流量,利用Morris水迷宮法檢測各組大鼠的記憶功能,結果顯示雙側頸總動脈永久結扎可導致大鼠出現(xiàn)慢性持續(xù)性腦血流量下降及持續(xù)性認知功能障礙,說明我們的慢性缺血致血管性癡呆大鼠造模成功。長期以來,免疫炎癥反應作為腦缺血損傷級聯(lián)反應中重要的一環(huán)一直倍受人們的關注。其中,IL-1β、IL-6及TNF-α被視為與中樞神經系統(tǒng)缺血相關的最主要炎癥反應分子。至今,人們對IL-1β、IL-6及TNF-α在缺血方面的研究多集中在急性腦缺血尤其是短暫腦缺血后再灌注方面,而在慢性腦缺血方面研究甚少,有關慢性腦缺血致血管性癡呆大鼠IL-1β、IL-6及TNF-α經時變化的基礎研究國內外尚未見報道。本實驗在前期工作基礎上,采用雙側頸總動脈永久結扎方法制備慢性前腦缺血動物模型,并采用免疫組織化學方法檢測癡呆大鼠海馬及顳葉皮質中炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α的經時變化,以期闡明IL-1β、IL-6及TNF-α在慢性腦缺血致血管性癡呆發(fā)病機制中的作用,為臨床上防治血管性癡呆提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1雙側頸總動脈永久粘結法選用長春高新醫(yī)學動物實驗研究中心提供的健康雄性Wistar大鼠150只,鼠齡3～5個月,體重300～350g。隨機分為對照組和實驗組,實驗組又分為手術后24h組、1w組、半個月組、1個月組、2個月組、3個月組及4個月組。采用雙側頸總動脈永久結扎方法制備慢性前腦缺血動物模型,具體方法如下:大鼠術前12h禁食,4h禁水。用1%戊巴比妥鈉(10mg/kg)腹腔注射麻醉,保證手術期間有自主呼吸。仰臥固定,頸部去毛、強力碘消毒后沿頸正中切開,分離雙側頸總動脈,并套以“0”號線。分別結扎雙側頸總動脈的遠近端,并從中間剪斷,以確保阻斷動脈血流。術中大鼠肛溫保持在36.5℃～37.5℃,手術后動物送至有通風和空調設備的動物房飼養(yǎng)。對照組(假手術組)除不結扎、不剪斷雙側頸總動脈外,其余過程與手術組相同。1.2行為測試采用Morris水迷宮法進行大鼠記憶功能的測定。1.3術后不同時間點大鼠術后不同時間點腦血流量比較應用瑞典PerimedAB公司生產的PeriFluxSystem5000型激光多普勒血流儀(LDP)檢測各組大鼠術后不同時間點(術后24h、1w、半個月、1個月、2個月、3個月、4個月)額葉、頂葉、海馬及皮質下區(qū)局部腦血流量(rCBF)。1.4免疫組化試驗免疫組織化學染色采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(SP法),其步驟如下:(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟經乙醇脫水;(2)PBS沖洗5min×3;(3)3%H2O2-蒸餾水阻斷內源性過氧化物酶25min;(4)PBS沖洗5min×3;(5)將切片置入盛有抗原修復液的容器中,抗原修復液為0.01molpH=6.0的枸櫞酸鹽緩沖液(工作液),置爐上加熱至溫度達到92℃～98℃之間,保持5min關火,5min后從爐上移下,待溫度冷卻至70℃,入PBS沖洗5min×3;(6)加山羊血清(1∶20)封閉30min;(7)傾去多余的血清,滴加適當稀釋的特異性一抗于切片上,4℃冰箱過夜;(8)PBS沖洗5min×3;(9)滴加二抗(IgG/Biotin),孵育40min;(10)PBS沖洗5min×3;(11)滴加三抗(S-A/HRP)孵育40min;(12)PBS沖洗5min×3;(13)DAB-蒸餾水溶液顯色,顯微鏡下觀察,控制反應時間;(14)Mayer蘇木精復染,二甲苯透明,中性樹膠封片。結果判定:免疫組化染色陽性結果為棕黃色或棕黑色顆粒。對照:用PBS代替一抗做陰性對照。定量分析計數(shù)方法:在顳葉、海馬區(qū)的錐體細胞層,在20×10倍光鏡下隨機選擇5個視野,做免疫反應陽性細胞數(shù)計數(shù),計數(shù)方法采用標準網格,以“個/視野”為單位,結果取5個視野的平均值。1.5統(tǒng)計分析本實驗各組資料結果均以χˉˉ±sχˉ±s表示,實驗組和對照組間比較采用t檢驗進行統(tǒng)計學處理。2結果2.1小鼠海馬il-1免疫陽性細胞計數(shù)結果IL-1β免疫陽性細胞胞漿內出現(xiàn)棕黃色顆粒。對照組有少許的IL-1β免疫陽性細胞,大鼠雙側頸總動脈永久結扎后24h海馬IL-1β免疫陽性細胞數(shù)即明顯增高并達高峰,顳葉在1w時達高峰,以后均逐漸下降,至4個月時仍明顯高于對照組(見表1)。2.2il-6免疫陽性細胞IL-6免疫陽性細胞胞漿內出現(xiàn)棕黃色顆粒。對照組有少許的IL-6免疫陽性細胞,大鼠雙側頸總動脈永久結扎后24h海馬及顳葉IL-6免疫陽性細胞數(shù)即明顯增高,并均于1w時達高峰,以后逐漸下降,至4個月時仍明顯高于對照組(見表2)。2.3大鼠雙側頸總動脈脫氫后tnf-免疫陽性細胞數(shù)的變化TNF-α免疫陽性細胞胞漿內出現(xiàn)棕黃色顆粒。對照組有少許的TNF-α免疫陽性細胞,大鼠雙側頸總動脈永久結扎后24h海馬及顳葉TNF-α免疫陽性細胞數(shù)即明顯增高,并均于1w時達高峰,以后逐漸下降,至4個月時仍明顯高于對照組(見表3)。3慢性腦缺血模型制備認知功能障礙是一個復雜的病理過程,發(fā)病機制有很多學說。與記憶有關的腦內結構主要是大腦皮質聯(lián)合區(qū)、海馬及其鄰近結構、丘腦等。遠事記憶貯存部位主要在大腦皮層特別是額葉、顳葉;近事記憶在邊緣系統(tǒng),其中海馬是近事記憶信息轉變、貯存的主要部位。前期工作中,我們選擇顳葉、海馬作為觀察點,發(fā)現(xiàn)顳葉皮質錐體細胞從術后24h出現(xiàn)水腫、缺血,以后逐漸發(fā)展成凝固性壞死、變性,錐體細胞慢性進行性脫失伴膠質細胞增生;海馬區(qū)錐體細胞也從最初的水腫、缺血逐步發(fā)展成嚴重脫失、基質疏松、微空泡形成,各實驗組均未見明顯梗死灶。Sontag等曾報道,將大鼠雙側頸總動脈結扎60min后處死,并無明顯的梗死灶,這與我們的研究結果相似。雖然各實驗組均未見明顯梗死灶,而大鼠的認知功能障礙卻持續(xù)存在,我們認為這與顳葉皮質及海馬區(qū)的神經元慢性進行性變性、脫失有關。以往認為,中樞神經系統(tǒng)(CNS)是受血腦屏障保護的“免疫特免器官”,腦組織僅有很低的免疫活性,然而近10年來不斷涌現(xiàn)的免疫組織化學與分子生物學證據(jù)表明,腦具有一個活躍的內源性免疫系統(tǒng),腦內的慢性炎癥可能在多種神經系統(tǒng)疾病的進行性神經元死亡過程中起重要作用。長期以來,免疫炎癥反應作為腦缺血損傷級聯(lián)反應中重要的一環(huán)一直倍受人們的關注。其中,IL-1β、IL-6及TNF-α被視為與中樞神經系統(tǒng)缺血相關的最主要炎癥反應分子。至今,人們對IL-1β、IL-6及TNF-α在缺血方面的研究多集中在急性腦缺血尤其是短暫腦缺血后再灌注方面,而在慢性腦缺血方面研究甚少,有關慢性腦缺血致血管性癡呆大鼠IL-1β、IL-6及TNF-α經時變化的基礎研究國內外尚未見報道。為了進一步探討慢性缺血致血管性癡呆的炎癥機制,本實驗采用雙側頸總動脈永久結扎方法制備慢性前腦缺血動物模型,通過免疫組織化學方法檢測癡呆大鼠海馬區(qū)及顳葉皮質IL-1β、IL-6及TNF-α的經時變化情況,研究發(fā)現(xiàn)對照組大鼠的海馬區(qū)及顳葉皮質僅有IL-1β、IL-6及TNF-α的少量表達,而大鼠雙側頸總動脈永久結扎后海馬區(qū)及顳葉皮質IL-1β、IL-6及TNF-α免疫陽性細胞數(shù)明顯增高,其免疫陽性細胞主要為星形膠質細胞、小膠質細胞和神經元。其中,IL-1β在海馬于術后24h呈現(xiàn)表達高峰,在顳葉則于1w時達高峰,以后均有所下降,直至4月其表達仍明顯高于對照組。而IL-6及TNF-α在海馬及顳葉均于1w時呈現(xiàn)表達高峰,以后逐漸下降,至4個月時表達仍明顯高于對照組。我們推測細胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α在慢性腦缺血大鼠腦內星形膠質細胞、小膠質細胞和神經元中的持續(xù)高表達,可能是由于大鼠腦血流量的持續(xù)下降引起。腦組織新陳代謝率很高,腦重量只占體重的2.2%,腦血流量卻占心輸出量的15%。當腦灌注壓開始降低時,正常組織通過擴張血管,動用循環(huán)儲備來維持rCBF不變,當rCBF進一步下降,因能量供應不足,出現(xiàn)細胞膜電位不穩(wěn),Na+-K+泵障礙,細胞膜功能受損。Kanno等研究認為,腦缺血的功能閾值為正常腦血流量的50%,當腦血流量低于正常的30%時,將出現(xiàn)梗死灶。本組實驗大鼠腦血流量下降程度未達到引起梗死的閾值,所以梗死灶出現(xiàn)較少,而這種腦血流的降低作為一種較弱的刺激,雖不足以引起神經細胞壞死,但可能會刺激星形膠質細胞、小膠質細胞和神經元分泌IL-1β、IL-6及TNF-α,并通過一系列免疫炎癥