紫花苜蓿組織培養(yǎng)再生植株的研究

紫花苜蓿組織培養(yǎng)再生植株的研究

關于苜蓿組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法自30年來，植物組織和細胞種植的科學研究取得了迅速發(fā)展，尤其是在植物育種中的一些獨特優(yōu)勢。如利用胚胎培養(yǎng)技術克服雜交不孕;用子房或胚珠培養(yǎng)進行人工授粉或試管受精獲得雜種后代;用花藥培養(yǎng)進行單倍體育種以縮短育種周期和提高選擇率,獲得純合二倍體;通過胚乳培養(yǎng)選育三倍體;利用原生質體培養(yǎng)進行體細胞雜交,外源遺傳物質的導入以及突變體篩選等。它具有增殖率高,周期短,占用空間小,不受季節(jié)限制,可以嚴格地控制培養(yǎng)條件等優(yōu)點。紫花苜蓿在我國已有2,000余年的栽培歷史,全國栽培面積現(xiàn)已達1,600萬畝,是我國最重要的豆科牧草。因此,開展對苜蓿組織培養(yǎng)的研究具有很大的意義。1972年,美國學者Saunders等人從未成熟的花藥、子房、子葉愈傷組織分化再生苜蓿植株成功,標志著苜蓿組織培養(yǎng)研究的開始。此后,進行了大量的研究,采用不同的分生組織、器官或原生質體,應用多種培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法進行不同目的研究,使這一領域的研究不斷深入。但上述研究大都采Blaydes培養(yǎng)基的基本成分,少數(shù)用N6和SH培養(yǎng)基,往往程序較多,也較復雜。據上海植物生理研究所楊燮試驗(1981)結果表明,MS培養(yǎng)基適用于苜蓿組織培養(yǎng),但從誘導愈傷組織到分化再生出植株需7個月時間。所用培養(yǎng)基為lmg/12,4-D+MS和2mg/lKT+0.25mg/lIAA+MS。為提高培養(yǎng)效率,本試驗采用MS無機鹽和有機成分為基礎加不同激素和蔗糖的處理方法,研究了苜蓿子葉再生植株的過程及不同基因型的影響。誘導愈傷組織的培養(yǎng)基分離、培養(yǎng)、保鮮、接種一、供試材料采用拉達克苜蓿為組織培養(yǎng)再生植株試驗材料。參與子葉誘導愈傷組織和分化植株能力試驗的品種計22個,包括滄縣苜蓿、武功苜蓿、和田苜蓿、熊岳苜蓿、保定苜蓿、印地安苜蓿、獵人河苜蓿、秘魯苜蓿、赤峰苜蓿、索伊H652苜蓿、克尼苜蓿、天津苜蓿、運城苜蓿、會寧苜蓿、安達瓦苜蓿、杜普梯苜蓿、切羅克苜蓿、拉達克苜蓿、Sirosal苜蓿、波蘭雜種苜蓿、公農一號苜蓿和潤布勒苜蓿等。這些品種除Sirosal是1983年從澳大利亞引進的原種外,其余均為本所1982年收獲的種子。二、方法將供試種子經過精選后放入試管中,先用水浸泡2～4小時,再用70%的酒精浸滲10分鐘,然后用10%的次氯酸鈣或2%的次氯酸鈉消毒20分鐘,再用12%的過氧化氫消毒10分鐘,最后用0.1%的氯化汞消毒8分鐘,再用無菌水沖洗4次,然后接種于瓊脂培養(yǎng)基中發(fā)芽,5天左右便可切取長出的展開子葉接種子愈傷組織誘導培養(yǎng)基中。用MS培養(yǎng)基為基本成分。根據試驗目的,以此為基礎對某些成分作適當?shù)恼{整,分別配制成誘導和保持愈傷組織的培養(yǎng)基(CMS)、分化再生植株的培養(yǎng)基(DMS)、誘導根的培養(yǎng)基(RMS)。高壓滅菌前以0.1N的HCl或KOH將培養(yǎng)基的pH調至5.8～6.0,然后將培養(yǎng)基分裝在容量為50ml的三角瓶中,每瓶201m,加棉塞并以牛皮紙封口,然后用123℃高壓滅菌消毒20分鐘,在無菌室冷卻凝固后即可接種。一般每30天繼代一次,培養(yǎng)室溫度為26±1℃,采用連續(xù)光照,以雙管40瓦日光燈為光源,光強為3,000Lux。培養(yǎng)基的誘導誘導一、苜蓿組織培養(yǎng)的植株再生1.愈傷組織的誘導和保持研究表明,在紫花苜蓿愈傷組織培養(yǎng)系統(tǒng)中,脫分化和分化過程受生長素和細胞激動素調控。據Mitten等人研究,拉達克是一個出愈率和再生分化能力較好的品種。我們將無菌發(fā)芽形成的子葉每5片接種于一瓶培養(yǎng)基中,每塊子葉重約4mg,每一處理接種50片,30天后記載出愈率和出愈的愈傷組織平均每塊鮮重。結果表明(表2):(1)2,4-D對愈傷組織的誘導是必不可少的,而且在0～2mg/l范圍內隨其濃度增加,出愈率及其鮮重均相應增加。(2)出愈率高的往往鮮重也大。鮮重的提高是細胞生長的標志,說明適于誘導愈傷組織啟動的營養(yǎng)成分同樣對愈傷組織細胞的分裂和生長有利。(3)細胞激動素KT對出愈率和鮮重有抑制作用,尤其是對愈傷組織的起動有明顯影響。觀察表明,在沒有KT而只有2mg/l2,4-D的培養(yǎng)基上,接種后第5天子葉切口的邊緣開始膨大,形成愈傷組織;而在2mg/l2,4-D+2mg/lKT的培養(yǎng)基上第14天才能見到上述現(xiàn)象。由此可見,KT對誘導愈傷組織并非必需,反而有抑制效應。因此,確定2mg/l2,4-D+MS為誘導和保持愈傷組織聽用的培養(yǎng)基(CMS)。該培養(yǎng)基具有誘導愈傷組織頻率高、生長快的特點。拉達克苜蓿子葉在該培養(yǎng)基上第5天便可見到愈傷組織啟動,第8天出愈率可達50%左右,第12天可達80%左右。2.植株的分化將CMS誘導培養(yǎng)30天的拉達克愈傷組織接種于除去2,4-D附加不同濃度KT和蔗糖組合的下列分化苗培養(yǎng)基中,每瓶接種5塊愈傷組織,每一處理接種50塊,中間繼代一次,60天后分化苗的結果列于表3。從表3可以得出如下幾點:(1)在沒有蔗糖和KT的培養(yǎng)基中均未分化出植株。(2)4mg/lKT+20g/l蔗糖+MS是分化苗的最佳組合,因此,確定它為以后試驗所用的分化苗培養(yǎng)基(DMS)。在該培養(yǎng)基上第18天就發(fā)現(xiàn)其中之一的愈傷組織,第一個開始出現(xiàn)魚雷狀突起一胚狀體開始形成的過程。此外,整個試驗過程發(fā)現(xiàn),分化植株的過程是以胚狀體形成的方式進行的,即首先從愈傷組織表面形成一種魚雷狀綠色突起,爾后逐步發(fā)育成肥壯的胚狀體進而成苗。3.根的誘導采用不同濃度的NAA(萘乙酸)和蔗糖處理組合,將在DMS中分化出來的幼苗展開兩片葉子時,從基部剪取接種于各處理水平的培養(yǎng)基中,每瓶3株,每一處理6株,觀察記載最早開始形成根所需的天數(shù)和20天時生根幼苗的百分率(表4)。由表4可見:(1)在沒有蔗糖和30g/l蔗糖的培養(yǎng)基中均未誘導出根,15g/l以上的蔗糖濃度對生根有抑制作用,雖然最終均100%地誘導出根,但與10g/l的蔗糖濃度相比,它們普遍晚幾天出現(xiàn)根,因而10g/l的蔗糖濃度被認為是最理想的蔗糖水平。NAA對促進生根在一定濃度范圍內是有效的,本試驗中1.0g/l和2.Omg/l的濃度均表現(xiàn)出最佳水平。因此,確定1.0mg/lNAA+10g/l蔗糖為誘導根的培養(yǎng)基(RMS)。4.再生苗移栽試驗在RMS培養(yǎng)基上誘導生根1個月時,一般每株幼苗均可長出5條以上健壯的根,這時便可移栽。先打開三角瓶塞在培養(yǎng)室鍛煉1～2天,然后移到室溫下再鍛煉1～2天,再小心取出幼苗,將根部的培養(yǎng)基沖洗干凈后可直接移栽到松軟、濕潤的花盆土壤中。為保持較濕潤的條件,先將花盆用塑料薄膜罩住移至大田或溫室中,3～5天后打開塑料薄膜,成活率可達80%以上。再生植株仍然保持原品種的特征特性,未發(fā)現(xiàn)變異,并在第二年5、6月份正常開花結實。至此,完成了從紫花苜蓿子葉愈傷組織的誘導至再生植株開花結實的全部過程。二、不同基因型品種的影響通過植物組織培養(yǎng)能否成功地再生植株,除培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是一個重要的因素外,另一個重要因素是材料的基因型。為了給今后的研究打下良好基礎,選出的材料必須有出愈率高、生長快、再生分化能力強而又不易老化等優(yōu)點。方法是:每個品種接種50片子葉,在CMS中誘導愈傷組織,30天時記載出愈率并測定其每塊平均鮮重,然后將愈傷組織轉移到DMS中進行分化苗試驗,60天后記載愈傷組織中出苗的百分率。從表5可以說明:(1)不同基因型品種的子葉在誘導愈傷組織的能力上差異遠不如分化苗能力的差異大。一般來說,不同的苜蓿品種子葉均可在適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下完成脫分化過程,但分化過程并非都能完成。其中有8個品種沒有分化出苗,有待于進一步研究。(2)鮮重大、生長速度快的愈傷組織分化苗的能力是否高,尚不能定論。鮮重小的品種一般都是出愈較晚所致。如武功苜蓿和和田苜蓿等幾個鮮重大的品種,接種后第4天子葉切口邊緣便可膨大,開始啟動和形成愈傷組織,而鮮重較小的品種,如獵人河苜蓿第7天才見到類似的現(xiàn)象。由此看出,武功苜蓿、和田苜蓿、拉達克苜蓿、保定苜蓿和運城苜蓿是出愈率和分化率較好的品種,至今已保持一年之久,仍有分化再生能力。植物激素的調節(jié)作用1.植物激素的調節(jié)作用紫花苜蓿組織培養(yǎng)再生植株的過程是分步完成的,各個階段植物激素起了明顯的調控作用。首先,在子葉誘導愈傷組織的階段,2,4-D就起了關鍵的調控作用。根據周嫦等人的報道,2,4-D的作用首先是與生物體內含精氨酸高的粗蛋白結合而解除部分DNA的束縛,恢復轉錄(mRNA合成)和轉譯(酶的合成)的作用,從而啟動細胞的分裂和生長,形成愈傷組織,KT第一階段對愈傷組織抑制作用的原因尚不清楚。第二階段中,由于2,4-D往往只有促進愈傷組織的形成和增殖,而抑制器官分化的作用,因而在分化苗過程中將它除去。KT在這一階段起了關鍵的調控作用。麥克利恩等人認為,KT調節(jié)分化的作用可能是由于它影響了細胞內有活性的tRNA分子群所引起的。試驗表明,NAA對誘導幼苗生根有一定的促進作用?？偟膩碚f,紫花苜蓿組織培養(yǎng)的器官分化過程是生長素和細胞激動素相互調節(jié)統(tǒng)一的結果,至于它們之間明確的作用界限,是一個很復雜的生理、生化機制問題,至今仍未徹底搞清。利用MS培養(yǎng)基對紫花苜蓿組織培養(yǎng)中植物激素之間調節(jié)作用的研究,至今還未見詳細報道,本試驗僅是一個初步探索。2.蔗糖的調節(jié)作用在分化幼苗和誘導生根過程中,可以發(fā)現(xiàn)蔗糖的調節(jié)作用。在紫花苜蓿組織培養(yǎng)的早期,可能是高水平的蔗糖作為碳源和能源啟動了幼苗的分化,一旦分化開始,其本身就有可能加劇進行光合作用,為自身的生理、生化過程提供碳源和能源,而這時高水平的蔗糖則可能起了一種反饋效應,抑制了光合作用過程,從而也抑制了器官的分化過程。在生根過程中,蔗糖可能只作為一種滲透調節(jié)因素參與代謝。Brown等人對煙草組織培養(yǎng)過程中蔗糖的作用進行的研究提出,在器官分化過程中,