新冠核酸檢測質(zhì)量管理制度(2023年)

****醫(yī)院冠核酸檢測質(zhì)量治理制度〔2023〕〔一〕提高核酸檢測標準性和時效性通過自助打印、網(wǎng)絡(luò)查詢、快遞郵寄等多種方式，為受檢者出具檢測報告。對于發(fā)熱門診患者的核酸檢測，要在6小時內(nèi)報告結(jié)果，爭取縮短至4小時報告；對于一般門急診、住院患者及陪護人員等人群的核酸檢測，原則上要在12小時24小時內(nèi)報告結(jié)果?！捕吵掷m(xù)開展核酸檢測培訓(xùn)要大力開展冠病毒核酸檢測培訓(xùn)，依據(jù)《冠肺炎實驗室檢測技術(shù)指南》《冠核酸檢測技術(shù)人員培訓(xùn)方案》等文件要求，加強標本采集、保存和運輸、標本接收整理、核酸提取、試劑使用、熒光定量等檢測方法、結(jié)果報告、生物安全等全流程培訓(xùn)。通過培訓(xùn)，確保各環(huán)節(jié)操作標準，進一步提高檢測技術(shù)水平?！踩惩苿俞t(yī)療機構(gòu)互認檢測結(jié)果明確互認的條件、有效期、醫(yī)療機構(gòu)范圍等，最大程度削減重復(fù)檢測。檢測部門要組織參與室間質(zhì)評，保證每年至少參與1次室間質(zhì)評。要加強試驗室室內(nèi)質(zhì)控，常態(tài)化承受國家級或省級臨床檢驗質(zhì)量把握，保證檢測質(zhì)量。****醫(yī)院冠核酸檢測要點總結(jié)〔2023〕一、SARS-CoV-2二、核酸檢測對于SARS-CoV-2檢測的意義三、試驗室進展SARS-CoV-2核酸檢測的條件和要求四、SARS-CoV-2核酸測定〔實時熒光RT-PCR〕關(guān)鍵環(huán)節(jié)五、SARS-CoV-2核酸測定〔實時熒光RT-PCR〕結(jié)果判讀六、SARS-CoV-2七、如何降低SARS-CoV-2核酸檢測假陰性SARS-CoV-2核酸檢測復(fù)檢陽性緣由九、總結(jié)嚴峻急性呼吸綜合征冠狀病毒2〔SARS-CoV-2〕可引起型冠狀病毒肺炎〔C0VID-19〕,目前已在全球范圍內(nèi)廣泛流行。疫情爆發(fā)初期，因進展快速，對疑似患者進展快速確診是防治C0VID-19的關(guān)鍵，局部獲批的核酸檢測試劑研發(fā)時間短，存在性能確認倉促、試劑優(yōu)化不充分以及批間差異大等問題；各臨床試驗室在開展核酸檢測過程的各個環(huán)節(jié)中存在的問題也可能影響核酸檢測結(jié)果的準確性。本文將圍繞目前SARS-CoV-2核酸檢測中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)及要點進展評述，并對試驗室核酸檢測與臨床不符假陰性和復(fù)檢陽性的問題進行分析。一、 SARS-CoV-2核酸檢測的原理SARS-CoV-2是一種RNA29kb,擁有1010RNA和蛋白構(gòu)成，最外層是由脂質(zhì)和糖蛋白組成的包膜外衣，里面蛋白衣殼將RNARNA宿主細胞進展復(fù)制。病毒核酸檢測的原理就是通過細胞裂解液，讓病毒的RNA〔RT-PCR〕進展檢測。檢測原理最關(guān)鍵的是利用引物和探針來實現(xiàn)核酸序列的“靶向匹配”,即查找SARS-CoV-2約3萬個堿基中區(qū)分于其他病毒的核酸序列〔與其他病毒核酸相像度“低”的區(qū)域〕，設(shè)計引物和探針。引物和探針與SARS-CoV-2核酸特定區(qū)域高度匹配，即特異性很強，一但待檢樣本實時熒光RT-PCR擴增結(jié)果為陽SARS-CoV-2o二、核酸檢測對于 SARS-CoV-2檢測的意義依據(jù)《型冠狀病毒肺炎診療方案〔試行第七版〕》要求：疑似病例同時具備以下病原學(xué)或血清學(xué)證據(jù)之一者：1RT-PCR病毒基因測序，與的型冠狀病毒高度同源；型冠狀病毒特異性IgM抗體和IgG抗體陽性；型冠狀病毒特異性IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性或恢復(fù)IgG4因此，SARS-CoV-2核酸檢測〔實時熒光RT-PCR〕結(jié)果陽性是確診感染的重要證據(jù)之一；但假設(shè)檢測結(jié)果為“陰性”，不能作為推斷患者未被感染的標準。有爭論結(jié)果顯示，1100例C0VID-19患者在入院時承受電子計算機斷層掃描〔CT〕檢查時，有76.4%的患者呈現(xiàn)出肺炎表現(xiàn)，主要為毛玻璃樣陰影〔50.0%〕和雙肺斑片狀陰影〔46.4%〕,絕大多數(shù)重癥患者都能以此確診。而依據(jù)此前專家表述的“確診患者中，核酸檢測的陽性率僅為30%50獷來看,COVID-19患者核酸檢測假陰性的比例并不低。因此核酸檢測不能作為確診感染的唯一方法。三、試驗室進展 SARS-CoV-2核酸檢測的條件和要求于醫(yī)療機構(gòu)開展型冠狀病毒核酸檢測有關(guān)要求的通知》的要求：到達二級以上試驗室生物安全防護及三級個人生物安全防護標準并經(jīng)衛(wèi)生行政相關(guān)部門批準，方可開展SARS-CoV-2保持空氣流淌，排解氣溶膠。核酸檢測人員必需具備相應(yīng)資質(zhì)，承受聚合酶鏈反響相關(guān)培訓(xùn)并考核合格。試驗室應(yīng)嚴格治理，分區(qū)到位，嚴格制止無關(guān)人員進入。清潔區(qū)應(yīng)保持通風(fēng)，消毒到位。相關(guān)物品分區(qū)放置，潔污分別，按時更換，洗消到位。常規(guī)消毒：較大面積以含氯消毒液為主，小面積可以用75%酒精。處理氣溶膠的良好方式是開窗通風(fēng)，也可通過紫外線、過濾、空氣消毒機等方式進展空氣消毒。四、SARS-CoV-2〔RT-PCR〕的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和參數(shù)核酸“提取”也是檢測成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，其與病毒樣本的采集和保存親熱相關(guān)。在《型冠狀病毒肺炎診療方案〔試行第六版〕》中，對于高風(fēng)險的樣本，在核酸提取和擴增前需要對樣本先行病毒滅活，包括〔6065〕?！?〔20~30〕min,或者用試劑盒自帶的采樣液滅活和保存病毒。2種方式，即以核酸提取裂解液為根底配制的滅活〔保存〕不再有傳染性，提高運輸和檢測階段的安全性；另一方面又RNA降解。為平衡鹽類、乙二胺四乙酸螯合劑、胭鹽〔異硫氟酸服、鹽酸胭等〕、陰離子外表活性劑〔十二烷基硫酸鈉〕、陽離子〔十四烷基三甲基草酸較8-羥基喳琳、二硫蘇糖醇、蛋白酶K等幾種或多種組分。目前，核酸提取的試劑盒種類繁多，承受的核酸提取純化試劑各不一樣，即使是承受一樣的核酸提取純化試劑，各試劑盒的提取程序也有所不同。目前國家藥品監(jiān)視治理局批準的核酸檢測試劑盒產(chǎn)品SARS-CoV-2ORFlabE和N有單靶區(qū)段〔ORFlab〕、雙靶區(qū)段〔ORFlab.N或E〕、三靶區(qū)段〔ORFlab.N和E〕的檢測和判讀差異，核酸提取和實時熒光RT-PCR反響體系應(yīng)參考相關(guān)試劑盒說明書，并建議使用者嚴格依據(jù)試劑盒說明書規(guī)定的判讀方式進展判讀。五、 SARS-CoV-2核酸測定〔實時熒光RT-PCR〕結(jié)果判讀〔其次版［7］首次明確了單個基因擴增結(jié)果的推斷標準:1CtCt2402、Ct<373Ct3740Ct<40,擴增曲線有明顯起峰，該樣本推斷為陽性，否則為陰性。［9］連續(xù)了上述標準，但是由于商品化試劑盒選用的靶標有所不同，上述3版指南并未給出靶標的組合推斷標準，強調(diào)以廠家供給的說明書為準。從第五版指南開頭，明確了2個靶標，尤其是比較難推斷的單靶標陽性的推斷標準，即試驗室要確認某個病例為SARS-CoV-2核酸檢測陽性，需滿足以下2個條件中的1同一份樣本中SARS-CoV-22個靶標(ORFlab.N)實時熒光RT-PCR檢測結(jié)果均為陽性，假設(shè)消滅單個靶標陽性的檢測結(jié)果則需要重采樣并重檢測，假設(shè)檢測結(jié)果照舊為單靶標陽性，則判定為陽性；2種樣本實時熒光RT-PCR同時消滅單靶標陽性或同種類型樣本2次采樣檢測均消滅單個靶標陽性的檢測結(jié)果，可判定為陽性。但是，指南同時強調(diào)核酸檢測的陰性結(jié)果不能排解SARS-CoV-2包括樣本質(zhì)量差(口咽等部位的呼吸道樣本)、樣本收集過早或過晚、沒有正確保存、運輸和處理樣本、技術(shù)本身存在問題(病毒變異、PCR六、SARS-CoV-2檢測結(jié)果與臨床表現(xiàn)不符的“假陰性”，即臨床病癥及影像COVID-19,但核酸檢測屢次始終為“陰性”。國家衛(wèi)生安康委臨床檢驗中心對SARS-CoV-2被感染者的細胞中有確定量的病毒?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)顯示機體被病毒感染后，病毒通過鼻腔和口腔進入到咽喉部，再到氣管和支氣管，進而到達肺泡，感染者會經(jīng)受埋伏期、輕度病癥、再到嚴峻病癥的過程，不同病程階段以及機體不同部位存在的病毒量有所不同。從細胞種類的病毒載量看，肺泡上皮細胞〔下呼吸道〕＞氣道上皮細胞〔上呼吸道〕〉成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和巨〔最優(yōu)鼻咽拭子〉口咽拭子》血液。此外，糞便中也能檢出病毒。但是考慮操作的便利性和患者的承受程度，目前臨床常用的樣本挨次是口咽部拭子》鼻咽部拭子》支氣管灌洗液〔操作簡潔〕和深痰〔常為干咳，難得到〕。低，假設(shè)只取口咽部或鼻咽部樣本檢測，病毒核酸就檢測不到。樣本采集時未采集到含有病毒的細胞，或未有效保存病毒核酸。①采集部位不當，如采集口咽拭子時，采集深度不夠，采集鼻咽拭子沒有采到鼻腔深處等，可能采集到的細胞絕大局部都是不含病毒的細胞；②采樣拭子使用錯誤，如拭子頭的材料推舉使用PE纖維、聚酯纖維、聚丙烯纖維等合成纖維，實際操作中使用了棉花等自然纖維〔對蛋白質(zhì)的吸附較強，不易洗脫〕和尼龍類的纖維〔吸水性不佳，導(dǎo)致采樣量缺乏〕；〔DNA/RNA〕的聚丙烯或聚乙烯塑料保存管，導(dǎo)致保存液中核酸濃度下降。實際操作中推舉使用聚乙烯-丙烯聚合物塑膠與某些特別處理的聚丙烯塑膠容器儲存病毒核酸。體外診斷試劑性能不佳。局部品牌的試劑由于研發(fā)時間短，也沒有使用臨床樣本進展必要的性能確認，可能存在對試劑優(yōu)化不充分以及試劑批間差異大等問題。此外，202*316—24SARS-CoV-2存在與多個核酸“提取”試劑搭配使用的狀況，這也是導(dǎo)致假陰性結(jié)果的主要緣由。即使承受同一核酸檢測試劑，由于核酸提取試劑的不同，分析敏感性也必定會存在差異。臨床試驗室操作不標準。樣本運輸保存條件、臨床試驗室的標準操作、結(jié)果判讀和質(zhì)量把握等是保證檢測結(jié)果202*316—24844701(83.1%)合格，143(16.9%)不合格，試驗室總體檢測狀況良好，但不同試驗室在人員操作力氣、單靶標陽性樣本解讀力氣以及質(zhì)量把握方面仍存在差異。七、如何降低 SARS-CoV-2核酸檢測假陰性降低核酸檢測假陰性應(yīng)相對應(yīng)地從產(chǎn)生假陰性的4個方面進展優(yōu)化。被感染者的細胞中有確定量的病毒。疑似感染者不可能支氣管灌洗液或糞便中有，假設(shè)能同時或在疾病進展的不同階段采集多種類型樣本進展檢測，會有助于避開假陰性的消滅。樣本采集時要采集到含有病毒的細胞。通過加強對樣本采集人員的培訓(xùn)，可以在很大程度上解決該問題。牢靠的體外診斷試劑。通過從國家層面開展試劑的檢測性能評價爭論，探討存在的問題，可以進一步改進試劑檢測效能，提高分析敏感性。臨床試驗室標準操作。通過加強對試驗室人員的培訓(xùn)，不斷完善試驗室質(zhì)量治理體系、保證合理的分區(qū)、提高人員檢測的力氣，可以削減因試驗室操作不當消滅的假陰性。八、康復(fù)出院患者 SARS-CoV-2核酸檢測復(fù)檢陽性的緣由定，COVTD-19患者治愈出院的標準之一就是連續(xù)兩次呼吸道標本核酸檢測陰性(采樣時間至少間隔24小時)，但有極少數(shù)出院患者再次消滅SARS-CoV-2核酸檢測陽性，其緣由是多樣的。SARS-CoV-2是一個病毒，對其致病機制、引發(fā)的疾病全貌和病程特點還需要進一步了解，所以一方面要加強14d安康監(jiān)測和安康指導(dǎo)，以對疾病的發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)歸的全過程加深生疏?；颊哂性俅胃腥静《镜目赡?。鐘南山院士說：由于治愈的患者體內(nèi)有抗體，因此SARS-CoV-2再次入侵時可被抗體消滅，再次感染的幾率不大，但“不大”并不代表“不會感染”，再次感染有多方面的緣由，可能是康復(fù)患者自身的緣由，也可能與病毒的變異有關(guān)，甚至可能是試驗室檢測SARS-CoV-2變異可能導(dǎo)致康復(fù)患者自身產(chǎn)生的抗體對變異病毒無效，假設(shè)患者再次感染變異病毒，則核酸檢測可能再次陽性。就試驗室檢測方法而言，每種檢測方法都有其局限性。SARS-CoV-2核酸檢測因基因序列的選擇、試劑的組成、方法的敏感程度等緣由，導(dǎo)致現(xiàn)有的試劑盒均有各自的檢測下限。當患者經(jīng)過治療后，體內(nèi)病毒削減，待檢樣本中病毒載量低于檢測下限時即會消滅“陰性”結(jié)果,但此結(jié)果并不意味著體內(nèi)病毒完全消逝，病毒有可能在停頓治療后“死灰復(fù)燃“，連續(xù)復(fù)制。因此，建議出院2~4周內(nèi)，每周復(fù)查1次。核酸為病毒的遺傳物質(zhì)，患者經(jīng)過抗病毒治療后病毒被殺滅,但殘留的病毒RNA片段照舊在人體內(nèi)存留，并沒有完全從體內(nèi)排出，有時在特定的環(huán)境下，可以存留較長的時間，而在這時進展核酸檢測，會消滅“一過性”陽性。隨RNA片段漸漸排盡后，核酸檢測結(jié)果可轉(zhuǎn)為陰性。SARS-CoV-2的核酸檢測結(jié)果只是證明病毒RNA的存在與否，不能證明病毒活性以及病毒是否具有傳播性。要證明核酸檢測再次陽性的患者是否會再次成為