白血病融合基因檢測綜述

白血病有關(guān)融合基因的檢測及意義白血病是造血系統(tǒng)的惡性克隆性疾病，由于造血干細胞受損，造成克隆中的白血病細胞失去進一步分化成熟的能力而停滯在細胞發(fā)育的不同階段。白血病細胞含有自我更新增強、增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等特點，患者會出現(xiàn)不同程度的貧血、出血、感染和浸潤的臨床癥狀，嚴重危害生命健康。近年來，隨著細胞生物學和分子生物學技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)認識到大部分的白血病中都存在著涉及缺失、重復、易位等染色體畸變，造成原癌基因或抑癌基因構(gòu)造變異，原癌基因激活或抑癌基因失活，產(chǎn)生新的融合基因，編碼融合蛋白?，F(xiàn)有報道的染色體畸變已有五十種以上，累及更多數(shù)目的融合基因，這些異常已經(jīng)逐步成為不同類型白血病的分子生物學特異性標志。白血病有關(guān)融合基因的種類多樣，常見的融合基因有BCR-ABL、AML1-ETO、PML-RARα、E2A-PBX1、MLL-AF4、TEL-AML1、SIL-TAL1、DEK-CAN、CBFβ-MYH11等。BCR（breakpointclusterregion）基因是BCR-ABL融合基因的構(gòu)成部分，與費城染色體（PhiladelphiaChromosome）的形成有關(guān)，含有兩種轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體。正常的BCR基因編碼產(chǎn)物的功效還尚未清晰，它編碼的蛋白含有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，是RAC1和CDC42的GTP酶激活蛋白。ABL1基因是編碼細胞質(zhì)和細胞核蛋白酪氨酸激酶的原癌基因，與細胞分化、細胞分裂、細胞粘附、應(yīng)激反映等生命活動有關(guān)?；罨腁BL1蛋白通過SH3構(gòu)造域受到負調(diào)控，SH3構(gòu)造域的缺失會造成ABL1基因轉(zhuǎn)化為癌基因。CDC2介導的磷酸化能夠調(diào)節(jié)ABL1酪氨酸激酶的DNA結(jié)合活化過程，表明ABL1可能在細胞周期中發(fā)揮作用。Nowell及Hungerford于1960年發(fā)現(xiàn)在慢性粒細胞性白血病（CML）患者外周血中有一種比G組染色體還小的近端著絲粒染色體，由于首先在美國費城（Philadelphia）發(fā)現(xiàn)，故命名為費城染色體。1971年O`Riordon運用熒光顯帶法確認費城染色體是第22號染色體長臂缺失大段后剩余的部分。1973年Rowley發(fā)現(xiàn)缺失下來的那部分普通易位到9號染色體長臂的末端，形成t（9；22）（q34；q11）。1982年Deklein等在費城染色體上初次發(fā)現(xiàn)了原來位于9號染色體長臂末端（9q34）的癌基因ABL1，證明費城染色體上有來自9號染色體長臂末端的片端，是22號染色體與9號染色體互相易位的產(chǎn)物。易位使9號染色體長臂（9q34）上的原癌基因ABL1和22號染色體（22q11）上的BCR基因重新組合成融合基因，因而稱為BCR-ABL融合基因。BCR-ABL融合基因編碼的融合蛋白含有很強的酪氨酸激酶活性，變化細胞多個蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化水平和細胞微絲機動蛋白的功效，擾亂細胞內(nèi)正常的信號傳導途徑，使細胞失去了對周邊環(huán)境的反映性，并克制凋亡的發(fā)生，影響細胞周期調(diào)控，造成骨髓造血干細胞過分增殖。BCR-ABL融合基因在病人中常見有四種剪接體mRNA：編碼P210融合蛋白的b2a2和b3a2，編碼P190的e1a2，編碼P230的e19a2。其中b3a2和b2a2重要存在于CML，ela2重要在急性淋巴細胞性白血病(ALL)中出現(xiàn)，而出現(xiàn)較少的e19a2根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）最新版的血液系統(tǒng)腫瘤分類原則，也應(yīng)被診療為CML。90%以上的CML患者血細胞中都發(fā)現(xiàn)有費城染色體的存在，重要為P210融合蛋白，因而費城染色體和BCR-ABL融合基因能夠作為分辨典型CML和非典型CML的診療指標。同時在費城染色體陽性的ALL患者中，65%的成人和80%的小朋友能夠檢測到P190融合蛋白陽性。由于BCR-ABL融合蛋白能夠收到多個小分子化合物的克制，臨床上第一代針對BCR-ABL融合蛋白的酪氨酸激酶小分子克制劑（TKI）伊馬替尼就是是通過結(jié)合克制BCR-ABL融合蛋白的酪氨酸激酶構(gòu)造域來克制其在細胞周期中的影響，從而發(fā)揮抗白血病作用的。第二代BCR-ABL酪氨酸激酶克制劑達沙替尼和尼洛替尼也是在這個基礎(chǔ)上進行改善，以以減少因伊馬替尼使用而帶來的抗藥性。對費城染色體和BCR-ABL融合基因的檢測，對于對的分辨CML類型，指導臨床治療和判斷預后狀況含有重要的指導作用。RUNX1（Runt-relatedtranscriptionfactor1）基因也被稱為AML1（acutemyeloidleukemia1）基因或CBFA2（core-bindingfactorsubunitalpha-2）基因，RUNX1基因編碼的RUNX1蛋白是調(diào)控造血干細胞分化為成熟血細胞的轉(zhuǎn)錄因子，是RUNX（Runt-relatedtranscriptionfactor）家族或CBFα（corebindingfactor-α）的組員，能夠與CBFβ蛋白形成異質(zhì)二聚體復合物，增強DNA結(jié)合和復合物的穩(wěn)定性。人的RUNX1基因全長260kb，在21號染色體（21q22.12）上，有兩個選擇性轉(zhuǎn)錄啟動子，能夠通過選擇性剪接形成多個轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體。全長的RUNX1蛋白由12個外顯子編碼形成，在這些外顯子中，包含有兩個構(gòu)造域，分別被命名為RHD（runthomologydomain）和TAD（transactivationsdomain），前者由2,、3、4號外顯子編碼形成，后者由6號外顯子編碼形成。RUNX1蛋白分別通過這些構(gòu)造域來介導DNA結(jié)合和蛋白間互相作用。RUNX1的轉(zhuǎn)錄過程受兩個增強子的調(diào)節(jié)，這些組織特異性的增強子能夠結(jié)合淋系或紅系調(diào)控蛋白，增進RUNX1基因在造血系統(tǒng)中的高度活化。RUNX1在胚胎發(fā)育的造血過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，在全部的造血部位都有體現(xiàn)，能增進造血干細胞和造血祖細胞的形成。在分子水平，RUNX1基因通過結(jié)合血小板生成素TPO（thrombopoietin）受體c-Mpl的啟動子，募集轉(zhuǎn)錄活化子或克制子，進而增進造血干細胞的生成或向其它造血細胞方向分化。RUNX1還能夠通過上調(diào)Smad6的體現(xiàn)來增進蛋白體降解。ETO基因又稱RUNX1T1基因，編碼的蛋白是一種鋅指構(gòu)造轉(zhuǎn)錄因子和癌蛋白。AML1-ETO融合基因重要見于急性髓系白血病（AML）患者中，t（8；21）（q22；q22）染色體易位造成21號染色體的原癌基因AML1基因和8號染色體的ETO基因融合，形成AML1-ETO和ETO-AML1融合基因。ETO-AML1不能通過聚合酶鏈式反映（PCR）檢測到，普通被認為其體現(xiàn)量極低或由于降解造成體現(xiàn)不穩(wěn)定。AML1-ETO融合基因體現(xiàn)的蛋白全長含有752個氨基酸，其N端為RUNX1（runt-relatedtranscriptionfactor1），也稱AML1區(qū)；C端是8號染色體編碼的RUNX1T1[runt-relatedtranscriptionfactor1;translocatedto,1(cyclinD-related)]，也稱ETO。AML1-ETO融合基因重要發(fā)生在M2型AML患者中（約40%），在M2b的陽性率達90%，因而能夠作為M2b分型診療的重要分子標志，少見于M4和M1，極少數(shù)骨髓增生異常綜合癥（myelodysplasticsyndrome,MDS）患者中也有AML1-ETO融合基因的存在。臨床上將AML1-ETO融合基因作為分子分型診療和預后觀察的一種重要根據(jù)，AML1-ETO融合基因陽性的患者預后較好。AML1-ETO陽性的白血病細胞有一定程度的分化能力，能分化為較成熟的嗜中性粒細胞核嗜酸性粒細胞，對化療反映較為敏感，因而AML1-ETO融合基因陽性的患者采用大劑量的阿糖胞苷治療，完全緩和率高達98%，5年存活率達成67%，預后較除M3外的其它亞型好。因而對初診患者的AML1-ETO融合基因檢測，對預后判斷和治療方案的制訂含有重要意義。PML（Promyelocyticleukemia）基因編碼的PML蛋白，屬于TRIM（tripartitemotif）家族的組員，定位在核小體上，含有轉(zhuǎn)錄因子和腫瘤克制蛋白的功效。PML的體現(xiàn)與細胞周期有關(guān)，能夠調(diào)節(jié)p53對致癌信號的反映。RARα（Retinoicacidreceptoralpha，維甲酸α受體）也叫NR1B1（nuclearreceptorsubfamily1，groupB，member1）基因，能編碼細胞核受體蛋白。維甲酸信號由兩種細胞核受體家族轉(zhuǎn)導，分別是RAR（retinoicacidreceptor）和RXR(retinoidXreceptor)，兩者能夠結(jié)合形成RXR/RAR異質(zhì)二聚體。在沒有配體存在的狀況下，DNA結(jié)合的RXR/RAR復合物通過募集共阻遏物NCOR1、NCOR2（SMRT）和組蛋白脫乙?；竵砜酥妻D(zhuǎn)錄過程的進行；當配體結(jié)合到復合物時，就能夠誘導構(gòu)像發(fā)生變化，允許募集共活化物、組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶，使轉(zhuǎn)錄過程進行下去。PML-RARα融合基因是急性早幼粒細胞白血?。╝cutepromyelocyticleukemia，APL）的特異性分子標志，見于98%的APL患者中。APL患者的特異性細胞遺傳學異常t（15；17）（q22；q21），造成15號染色體上的早幼粒細胞白血病基因（PML）和17號染色體上的維甲酸受體α（RARα）形成PML-RARα融合基因。正常的RARα等位基因編碼野生型維甲酸受體，與維甲酸結(jié)合能夠調(diào)節(jié)多個靶基因的轉(zhuǎn)錄。PML是POD（PMLoncogenicdomain）多蛋白復合體的核心組分，通過轉(zhuǎn)錄共激活作用，能夠克制腫瘤生長，在多個凋亡途徑中起重要作用。形成PML-RARα融合基因后，維甲酸核受體基因體現(xiàn)受克制，使維甲酸對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功效喪失；PML-RARα融合蛋白通過負顯性克制作用克制早幼粒細胞分化成熟；PML去定位使POD的構(gòu)造破壞，形成上百個細小顆粒分布在核及胞質(zhì)中，正常的克制增殖和促凋亡功效發(fā)生障礙，造成細胞大量增殖，凋亡減少，這些造成了APL的發(fā)生。形成PML-RARα融合基因的RARα部分斷裂位點位于2號內(nèi)含子上，而PML部分的斷裂位點有三種，因此將PML-RARα融合基因分為三類：1）PML斷裂位點在6號內(nèi)含子上的BCR1型（L型），占APL患者的55%；2）PML斷裂位點在6號外顯子上的BCR2型（V型），占APL患者的5%；3）PML斷裂位點在3號內(nèi)含子上的BCR3型（S型），占APL患者的40%。由于PML-RARα融合基因與APL發(fā)生的重要有關(guān)性，臨床上已經(jīng)將PML-RARα融合基因作為動態(tài)評定患者病情及預后的重要根據(jù)。E2A基因編碼蛋白能夠與NeuroD形成二聚體復合物，調(diào)控多個基因的轉(zhuǎn)錄過程。PBX1（Pre-B-cellleukemiatranscriptionfactor1）基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子PBX1能夠與HOXB1、MEIS1和HOXB7等蛋白互相作用，形成復合物，結(jié)合到DNA上，增進轉(zhuǎn)錄過程的進行。臨床中發(fā)現(xiàn)的E2A-PBX1融合基因是由t（1；19）（q23；p13）易位形成的，編碼的融合蛋白中E2A氨基端轉(zhuǎn)錄活化域結(jié)合到PBX1同源構(gòu)造域蛋白的DNA結(jié)合域上，是急性淋巴細胞白血?。ˋLL）中常見的染色體畸變，見于3-5%的小朋友ALL患者和3%左右的成人前B-ALL患者中，在小朋友前體B細胞ALL（precursor-BALL）患者中20-~25%能夠檢測到E2A-PBX1融合基因陽性。E2A基因13號外顯子和PBX1的2號外顯子斷裂后相連接，形成E2A-PBX1融合基因，同時在5-10%的E2A-PBX1融合基因陽性患者中發(fā)現(xiàn)連接點處有27個核苷酸的突變，編碼出兩種不同的蛋白P85和fy77，兩者只在PBX1部分的羧基端存在差別，并都含有轉(zhuǎn)化特性，屬于癌蛋白。近年來隨著化療方案的改善，對于E2A-PBX1融合基因陽性的ALL小朋友采用更強烈的化療方案，能夠改善其預后，5年無病生存率（EFS）已達89.5%。E2A-PBX1融合基因陽性和預后關(guān)系不明顯，但是能夠作為ALL和微小殘留病變（MRD）診療分子標志。DEK癌基因編碼的蛋白含有一種SAP構(gòu)造域，該蛋白能夠結(jié)合到十字形和超螺旋DNA上，誘導閉環(huán)DNA出現(xiàn)超螺旋構(gòu)造，并且與mRNA形成中剪接位點的選擇親密有關(guān)。該區(qū)域的染色體異常會增加DEK基因的體現(xiàn)，產(chǎn)生針對DEK蛋白的抗體，引發(fā)多個疾病。CAN基因又稱為Nup214（Nuclearporecomplex，核孔復合物）基因，它編碼的核孔復合物蛋白是延伸通過核膜的重要構(gòu)造，形成一種能夠調(diào)節(jié)大分子在細胞核與細胞質(zhì)之間流通的通道。CAN基因編碼的蛋白定位在核孔復合物的細胞質(zhì)一面，是細胞周期和核質(zhì)轉(zhuǎn)運正常運行的必要調(diào)節(jié)。DEK-CAN融合基因是由VonLindern等人在1990年研究發(fā)現(xiàn)的t（6；9）（p23；q34）易位，造成6號染色體上的DEK基因和9號染色體上的CAN基因融合形成的。CAN基因的3’部分和DEK基因的5’部分發(fā)生融合，在6號染色體短臂上產(chǎn)生DEK-CAN融合基因，轉(zhuǎn)錄形成一種異常的5.5kb的mRNA。DEK-CAN融合基因重要見于急性髓系白血?。ˋML）的M2型和M4型中，也見于M1型，且經(jīng)常是唯一存在的核型，發(fā)生率為0.5%~4%，這種異常也存在于MDS的難治性貧血伴原始細胞增多癥（RAEB）中。伴有這種染色體異常的患者的年紀普通比較輕，且預后較差。對于DEK-CAN融合基因的檢測，有助于輔助診療分型和判斷預后。SIL-TAL1融合基因僅見于急性T淋巴細胞白血病中（T-ALL），約占26%，由1p32的部分缺失形成，是T-ALL的特異性克隆標志，是小朋友T-ALL患者中最為常見的一類染色體異常，在小朋友患者中出現(xiàn)的頻率要遠高于成人患者。由TAL1基因的5’端丟失，與SIL基因的5’端融合，形成SIL-TAL1融合基因，TAL1編碼序列在SIL啟動子的調(diào)控下在T細胞中體現(xiàn)。SIL基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA存在于整個細胞周期中，其編碼的含有1283個氨基酸的胞質(zhì)蛋白，在細胞進入G2期時積累，在細胞周期完畢時降解。而SIL-TAL1融合基因的形成，引發(fā)了細胞周期調(diào)控的異常，造成白血病的發(fā)生。臨床上SIL-TAL1融合基因的檢測能夠輔助分型診療和MRD的監(jiān)測。CBFβ（Core-bindingfactorsubunitbeta）基因編碼的蛋白是二聚體核結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的beta亞基，屬于PEBP2/CBF轉(zhuǎn)錄因子家族，基因特異性的調(diào)控造血過程和成骨作用的進行。CBFβ蛋白亞基是一種非DNA結(jié)合亞基，它通過別構(gòu)作用增強DNA和alpha亞基的結(jié)合，并使結(jié)合后的復合物結(jié)合到多個增強子和啟動子的核心區(qū)。CBFβ基因能夠選擇性剪接形成兩種mRNA，每種編碼不同的羧基末端。MYH11基因編碼的myosin-11蛋白是一種平滑肌肌球蛋白，屬于肌球蛋白重鏈家族，是一種包含2條重鏈亞基和2對輕鏈亞基的六聚體蛋白亞基，能夠通過ATP的水解來將化學能量轉(zhuǎn)換為動能。CBFβ-MYH11融合基因是在多為AML-M4伴嗜酸性細胞增多癥，但亦可見于其它類型，如M1、M2、M4、M5、M7和慢性髓系白血病(CML)急變，是由inv（16）（p13；q22）造成16號染色體長臂的核心結(jié)合因子（CBF）β鏈基因和短臂的MYH11基因發(fā)生融合形成的，見于8-9%的初診AML患者中。它含有CBFβ-MYH11和MYH11-CBFβ兩種形式的融合基因，其中前者對M4EO的致病可能含有重要作用。研究顯示CBFβ基因的斷裂位點靠近3’端編碼區(qū)的17個氨基酸處，而MYH11基因的斷裂點存在著最少3種不同的方式，能形成10種以上的不同剪接體重排，同時這些重排仍然保持著融合基因轉(zhuǎn)錄本的開放閱讀框，常見的三種剪接體為A型，D型和E型。85%的CBFβ-MYH11融合基因陽性患者為A型，D型和E型各占5%。CBFβ-MYH11融合基因的產(chǎn)生能夠增進白血病的發(fā)生，但是含有CBFβ-MYH11融合基因的M4EO白血病患者預后較好。研究表明CBFβ-MYH11融合基因在患者治療緩和后能夠消失，因此該基因能夠用于MRD的檢測和預后判斷。MLL（Myeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia）基因編碼轉(zhuǎn)錄共激活物，是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，能夠正調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過程，對早期發(fā)育過程的基因體現(xiàn)和造血功效含有不可缺少的作用。即使ML的功效仍有諸多未能研究清晰，但是已有報道表明MLL在發(fā)育過程的細胞分裂中起著核心作用。同時MLL還是HOX基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，HOX基因在造血生成中發(fā)揮核心的作用，當MLL蛋白功效異常時，HOX基因體現(xiàn)下調(diào)，進而影響正常造血功效?；旌献V系白血?。∕ixedLineageLeukemia，MLL）基因重排發(fā)生在11號染色體2區(qū)3帶，MLL蛋白涉及三個功效區(qū)，分別是轉(zhuǎn)錄克制區(qū)、轉(zhuǎn)錄激活區(qū)和DNA結(jié)合區(qū)。MLL基因重排使得AT鉤區(qū)和鋅指構(gòu)造之間的序列發(fā)生斷裂，在DNA修復時與其它基因發(fā)生融合。MLL基因重排涉及五十余種染色體易位，產(chǎn)生不同的融合基因，常見的MLL重排形成的融合基因有MLL-AF4、MLL-AF6、MLL-AF9、MLL-F10、MLL-ENL、MLL-ELL等。MLL-AF4融合基因由t（4；11）（q21；q23）易位形成，是前B-ALL中最為常見的11q23易位，由MLL和AF4基因融合形成，含有6種不同的剪接體，分別為e9e5、e9e4、e10e5、e10e4、e11e5、e11e4。MLL-AF4融合基因在不同年紀段的發(fā)生率不同，嬰兒ALL中最多見，發(fā)生率為40-60%，在小朋友和成人中較低，約為5%。在嬰兒ALL中檢測出MLL-AF4提示預后良好，而相反若在成人ALL中檢測出MLL-AF4則提示預后較差。在小兒ALL中出現(xiàn)MLL-AF4時，年紀的不同預后并不一致。MLL-AF6融合基因由t(6;11)(q27;q23)易位形成，重要發(fā)生在AML的M4和M5a分型中，在小朋友AML患者中的比例為2-5%，成人患者中較少出現(xiàn)。MLL-AF9融合基因由t(9;11)(p22;q23)易位形成，是11q23異常中最常見的易位形式，重要出現(xiàn)在AML的M5a患者中，在小朋友AML患者中發(fā)生率為8-10%，在成人中為1-2%，總的預后良好，但是患者的年紀等多個指標的差別也決定預后的差別。根據(jù)報道，含有MLL-AF9的小鼠能夠造成AML的發(fā)生，但單純的MLL基因異常不會造成白血病發(fā)生，表明MLL重排形成融合基因或有伙伴染色體基因的參加是白血病發(fā)生的必需條件。MLL-AF10融合基因由t(10;11)(p13;q23)易位形成，重要見于小朋友AML-M5患者中，預后不良，且變異復雜易位更常見。MLL-ELL融合基因由t(11;19)(q23;p13.1)易位形成，在AML患者中的發(fā)生率較低，已有報道顯示其重要在M5a分型中出現(xiàn)，以成年人為主，預后不良，2年無病生存率50%。MLL-ENL融合基因由t(11;19)(q23;p13.3)易位形成的，可見于前B-ALL、前T-ALL、M4、M5、M1、M2多個白血病中，以嬰幼兒患者為主，發(fā)生率較低。因此對MLL重排形成的這些融合基因的檢測，對臨床的分型診療、治療及預后判斷都含有重要價值。TEL基因又稱為ETV6基因，定位在12號染色體短臂上，能夠編碼ETS家族轉(zhuǎn)錄因子，編碼的蛋白包含兩個功效構(gòu)造域：能夠與其它蛋白相結(jié)合的PNT構(gòu)造域和C末端DNA結(jié)合構(gòu)造域。對小鼠的TEL基因進行Knockout實驗，研究成果發(fā)現(xiàn)該基因?qū)υ煅芰脱芫W(wǎng)絡(luò)發(fā)生的維持必不可少。TEL-AML1融合基因是小朋友白血病常見的融合基因，由t（12；21）（p13；q22）易位，造成12號染色體上的TEL基因與21號染色體上的AML1基因融合形成，見于25%的前體B細胞ALL，在小朋友的普通ALL中也有較高的體現(xiàn)（10~20%），未見于成熟的B-ALL和T-ALL中。TEL和AML1編碼對正常造血功效含有核心作用的核酸轉(zhuǎn)錄因子，融合基因的形成擾亂了TEL的正常功效，并形成轉(zhuǎn)錄克制子克制AML1靶基因的體現(xiàn)，最后造成白血病的發(fā)生?，F(xiàn)在已報道的轉(zhuǎn)錄亞型有兩種：較多的是TEL的5號外顯子與AML1的2號外顯子結(jié)合（90%），較少的是TEL的5號外顯子與AML1的3號外顯子結(jié)合（10%）。對于TEL-AML1陽性的ALL患者的預后狀況現(xiàn)在仍然存有爭議，但是有報道認為TEL-AML1融合基因?qū)颊叩?年無病生存率有關(guān)，是預后良好的重要指標。因而臨床中對TEL-AML1的檢測，重要用于對輔助ALL分型，監(jiān)測MRD和預后狀況?，F(xiàn)在，臨床或?qū)嶒炇矣糜诎籽∮嘘P(guān)融合基因檢測的辦法有多個，常見的涉及如熒光原位雜交（FISH）、巢式RT-PCR、實時定量RT-PCR、多重RT-PCR+寡核苷酸芯片等。熒光原位雜交（FISH）技術(shù)是通過標記熒光素的單鏈DNA（特異性探針）和與其互補的DNA（標本）雜交，通過熒光信號的數(shù)量和位置反映標本對應(yīng)特異性基因的狀況。用于白血病有關(guān)融合基因的檢測中，F(xiàn)ISH定量精確、形象直觀、特異性較強，但是對操作規(guī)定較高，成本較高，敏捷度最高達10-2，不能滿足臨床對于白血病和MRD檢測水平的規(guī)定，應(yīng)用受到限制。實時定量RT-PCR（Real-timereversetranscriptionquantitativepolymerasechainreaction）技術(shù)檢測白血病融合基因的辦法，是在實時定量PCR的基礎(chǔ)上，增加逆轉(zhuǎn)錄過程，可用來檢測融合基因的mRNA水平。實時定量PCR技術(shù)是在普通PCR反映中加入能與PCR產(chǎn)物結(jié)合的熒光探針或熒光染料，并使它們發(fā)出的熒光信號隨著擴增產(chǎn)物的增加而成比例增加，通過熒光探測儀實時檢測每一種循環(huán)結(jié)束后的熒光強度，通過與原則曲線對比得出定量成果，能夠直接檢測目的基因的起始數(shù)量。實時定量PCR技術(shù)中SYBRGreen法和Taqman探針法兩種最為慣用：前者采用SYBRGreen染料來監(jiān)測擴增過程，隨著擴增反映的進行，游離狀態(tài)不發(fā)熒光的SYBRGreen染料非特異性結(jié)合到DNA雙鏈中產(chǎn)生熒光；后者采用Taqman探針，該探針能被Taq酶水解，探針的5’端帶有熒光報告基團，3’端帶有熒光淬滅基團，當兩個基團靠近的時候報告基團不發(fā)出熒光，隨著擴增反映的進行，5’端的報告基因由于探針被水解而脫離下來而產(chǎn)生熒光。SYBRGreen法價格便宜，能夠和任意的模板引物搭配，但容易受到非特異性擴增的影響；Taqman探針法更為精確，但是必須設(shè)計特異性的探針與引物模板配合，價格較貴。實時定量RT-PCR技術(shù)將逆轉(zhuǎn)錄過程和PCR過程結(jié)合起來，無需開蓋，一步法操作，減少污染機會；操作簡便、特異性強、敏捷度高；擴增過程中閉管操作，實時數(shù)據(jù)監(jiān)測，減少了污染機會，減少假陽性成果；無需電泳，大大縮短了操作時間，減少了操作的繁瑣；通過定量內(nèi)參基因來評價操作質(zhì)量，減少了假陰性成果。該辦法成本也較低，適合在臨床應(yīng)用中開展。巢式RT-PCR是一種變異PCR，使用兩對PCR引物擴增同一種片段。第一對PCR引物擴增和普通PCR相似，第二對引物稱為巢式引物，引物它們結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增片段。巢式PCR特異性強，如果第一次擴增出錯，則第二次繼續(xù)進行擴增的概率極低，但是最后的成果需要用電泳實驗觀察，總體流程繁瑣，無法精擬定量檢測白血病融合基因。多重巢式RT-PCR+寡核苷酸芯片檢測辦法，是在巢式RT-PCR的基礎(chǔ)上，在兩輪PCR中都平行設(shè)立針對多組融合基因的引物，同時檢測多個融合基因的剪接體，全部基因的第二輪上游引物在合成時用熒光素在5’端進行熒光標記，全部分型探針再3’端進行氨基修士。這樣通過多重巢式PCR，一次能夠擴增出多個可能存在的融合基因，再與全部分型探針在芯片上雜交，鑒定具體的融合基因類型。該辦法敏捷度較高，能夠同時檢測多個融合基因，但成本較高，操作較為復雜。WHO有關(guān)白血病分型的原則中將BCR-ABL、PML-RARα、AML1-ETO融合基因等某些常見的染色體異常歸納入白血病基本診療原則，更闡明了對這些融合基因的檢測，對于白血病的診療和治療含有重要的意義：檢測成果不僅可覺得白血病診療分型和預后判斷提供重要根據(jù)，減少人為主觀的判斷，使白血病的診療分型更加科學化和規(guī)范化，同時也是白血病微小殘留病變（MRD）檢測的基礎(chǔ)，對白血病的臨床個性化治療的開展含有重要的推動作用。參考文獻JGabert,EBeillard,VHJvanderVelden,etal.Standardizationandqualitycontrolstudiesof‘real-time’quantitativereversetranscriptasepolymerasechainreactionoffusiongenetranscriptsforresidualdiseasedetectioninleukemia–AEuropeAgainstCancerProgram.Leukemia,,17:2318–2357.JJMvanDongen,EAMacintyre,JAGabert,etal.StandardizedRT-PCRanalysisoffusiongenetranscriptsfromchromosomeaberrationsinacuteleukemiafordetectionofminimalresidualdisease.Leukemia,1999,13:1901–1928.YoonsooHahn,TapanKumarBera,KristenGehlhaus,etal.Findingfusiongenesresultingfromchromosomerearrangementbyanalyzingtheexpressedsequencedatabases.PNAS,,101(36):13257–13261.李家增，王鴻利，韓忠朝.血液實驗學.上海：上?？茖W技術(shù)出版社，1997.JScore,MJCalasanz,OOttman,etal.Analysisofgenomicbreakpointsinp190andp210BCR–ABLindicatedistinctmechanismsofformation.Leukemia,,24:1742–1750.陽成波，印遇龍，黃瑞林等.實時定量RT-PCR的原理及辦法.免疫學雜志，,19(3):S145-S150.BrianV.Balgobind,SusanaC,etal.Novelprognosticsubgroupsinchildhood11q23/MLL-rearrangedacutemyeloidleukemia:resultsofaninternationalretrospectivestudy.Blood,,114(12):2489-2496.LamK,ZhangDE.RUNX1andRUNX1-ETO:rolesinhematopoiesisandleukemogenesis.FrontBiosci.,1(17):1120–1139.EBeillard,NPallisgaard,VHJvanderVelden,etal.Evaluationofcandidatecontrolgenesfordiagnosisandresidualdiseasedetectioninleukemicpatientsusing‘real-time’quantitativereverse-transcriptasepolymerasechainreaction(RQ-PCR)–aEuropeagainstcancerprogram.Leukemia,,17:2474–2486.JamesW.Vardiman,JüergenThiele,DanielA.Arber,etal.TherevisionoftheWorldHealthOrganization(WHO)classificationofmyeloidneoplasmsandacuteleukemia:rationaleandimportantchanges.Blood,,114(5):937-951.BorkhardtA,CazzanigaG,ViehmannS,etal.IncidenceandclinicalrelevanceofTEL/AML1fusiongenesinchildrenwithacutelymphoblasticleukemiaenrolledintheGermanandItalianmulti-centertherapytrials.AssociazioneItalianaEma-tologiaOncologiaPediatricaandtheBerlin-Frankfurt-MunsterStudyGroup.Blood,1997,90:571-577.BloomfieldCD,GoldmanAI,AlimenaG,etal.Chromosomalabnormalitiesidentifyhigh-riskandlow-riskpatientswithacutelymphoblasticleuke-mia.Blood,1986,67:415-420.ArmstrongSA,LookAT.Moleculargeneticsofacutelymphoblasticleukemia.JClinOncol,,23:6306-6315.PuiCH,RobisonLL,LookAT.Acutelymphoblas-ticleukaemia.Lancet,,371:1030-1043.MellentinJD,NourseJ,HungerSP,etal.Molecularanalysisofthet(1;19)breakpointclusterregioninpre-Bcellacutelymphoblasticleukemias.GenesChromosomesCancer,1990,2:239–247.NourseJ,MellentinJD,GaliliN,etal.Chromosomaltranslocationt(1;19)resultsinsynthesisofahomeoboxfusionmRNAthatcodesforapotentialchimerictranscriptionfactor.Cell,1990,60:535–545.KampsMP,MurreC,SunXH,etal.AnewhomeoboxgenecontributestheDNAbindingdomainofthet(1;19)translocationproteininpre-BALL.Cell,1990,60:547–555.CristWM,CarrollAJ,ShusterJJ,etal.Poorprognosisofchildrenwithpre-Bacutelymphoblasticleukemiaisassociatedwiththet(1;19)(q23;p13):aPediatricOncologyGroupstudy.Blood,1990,76:117–122.HungerSP,SunT,BoswellAF,etal.HyperdiploidyandE2A-PBX1fusioninanadultwitht(1;19)+acutelymphoblasticleukemia:casereportandreviewoftheliterature.GenesChromosomesCancer,1997,20:392–398.BorowitzMJ,HungerSP,CarrollAJ,etal.Predictabilityofthet(1;19)(q23;p13)fromsurfaceantigenphenotype:implicationsforscreeningcasesofchildhoodacutelymphoblasticleukemiaformolecularanalysis:aPediatricOncologyGroups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