小鼠基因改造的基本技術(shù)

小鼠基因改造的基本技術(shù)

1不同的近交系小鼠作為一個(gè)不同層次的研究體系，大鼠可以被比作完整樣本的生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系統(tǒng)。小鼠亦有許多不同的品系,不同性質(zhì)的實(shí)驗(yàn)可能必須在合適的小鼠品系上進(jìn)行才能得到最佳結(jié)果。小鼠品系可以基本分為二大類。一類是近交系,也就是所謂“純系”,理論上同一個(gè)近交系內(nèi)的小鼠有完全相同的基因組序列,所以沒(méi)有個(gè)體遺傳背景的差別;另一類是遠(yuǎn)交群,相同遠(yuǎn)交群品系的小鼠個(gè)體之前存在著一定程度的遺傳多樣性,而這種遺傳多樣性的維持是通過(guò)大種群及特殊的配對(duì)交配系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。因此,個(gè)體實(shí)驗(yàn)室在利用遠(yuǎn)交群小鼠做實(shí)驗(yàn)時(shí),應(yīng)該購(gòu)買商業(yè)化公司或國(guó)家中心的小鼠,而不可以用自己繁殖的小鼠。常用的遠(yuǎn)交群小鼠品系有CD-1(又稱ICR)和昆明種小鼠等。近交系小鼠的遺傳一致性保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的個(gè)體誤差較小,因此絕大多數(shù)基因功能研究的實(shí)驗(yàn)選用近交系小鼠。主要的近交系小鼠品系有C57BL/6J、C3H、Balb/c、129和FVB等。由于特定的疾病模型有時(shí)必須在特定的近交系背景上才能表現(xiàn)出來(lái),因此選用不同的近交系必須參照文獻(xiàn)嚴(yán)格執(zhí)行,如換用了其他近交系,很可能得不到預(yù)期的效果。例如,db/db小鼠攜帶有Leptin基因的突變,從而表現(xiàn)出Ⅱ型糖尿病的癥狀,通常用的db/db小鼠有兩種遺傳背景選擇。一種是C57BL/6J(簡(jiǎn)稱B6),一種是C57BLKS/J。兩種背景的小鼠雖然都在4周開(kāi)始出現(xiàn)高血糖和高胰島素,但B6背景的突變小鼠會(huì)隨后產(chǎn)生胰島β細(xì)胞的代償性增生,提高了胰島素水平,從而導(dǎo)致3～4個(gè)月齡后小鼠血糖恢復(fù)正常。而在C57BLKS/J背景下,小鼠的高血糖表型不能恢復(fù),所以在檢測(cè)降血糖藥物時(shí),使用C57BLKS/J背景的db/db更為合適。在我們建立轉(zhuǎn)基因小鼠和基因剔除小鼠時(shí),最初的遺傳背景常常和我們最終使用的遺傳背景不一致,或者最初的遺傳背景不是近交系的背景,而是雜合的背景,這時(shí)我們有時(shí)必須通過(guò)回交的辦法來(lái)建立相對(duì)純合的遺傳背景。例如,最早建立的小鼠胚胎干細(xì)胞是129背景的,因此利用這些ES細(xì)胞建立的基因剔除小鼠也是在129SV的背景上。由于129小鼠的繁殖非常困難,所以在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室我們用B6品系小鼠來(lái)繁育這些基因剔除小鼠,導(dǎo)致了得到的小鼠同時(shí)有來(lái)自129和B6兩種不同的染色體片段,這種被稱做為雜合背景。由于不同遺傳背景的表型本身存在差異,因此雜合背景給特定研究帶來(lái)很大的個(gè)體差異。這種差異對(duì)于行為學(xué)檢測(cè)尤其明顯。以疼痛為例,B6小鼠對(duì)熱的敏感性和129相比要超過(guò)兩倍,而對(duì)嗎啡因的敏感性則比129要差近3倍。因此,如果科學(xué)家研究特定基因?qū)ν从X(jué)的敏感性的作用,那么最好要將基因剔除小鼠的遺傳背景固定到特定品系上才能獲得精確的數(shù)據(jù)。遺傳背景的純化通常是通過(guò)回交5～10代實(shí)現(xiàn)的。拿到一個(gè)雜合品系的小鼠后,我們可以首先將雜合品系的雌性小鼠和近交系(以B6品系為例)的雄鼠交配,這樣得到的F1代雄性小鼠的Y染色體是來(lái)自B6的,而其余常染色體有一半來(lái)自于B6。第二步是將F1代的雄鼠和B6雌鼠再回交,這樣得到的后代雄性小鼠(N2代)所有性染色體(X和Y)均來(lái)自B6,而其余常染色體理論上B6占75%。以此類推,在N4代之后,B6成分將達(dá)到96%以上。用N4代以上的回交小鼠做實(shí)驗(yàn),目前是許多實(shí)驗(yàn)室的共識(shí),不少高質(zhì)量的雜志也已經(jīng)開(kāi)始要求提交論文的相關(guān)數(shù)據(jù)必須來(lái)自于N4或N5以上的小鼠。2特定基因型的基因清除小鼠可能由于現(xiàn)有的小鼠近交系品系大多數(shù)起源于有限的一些野生小家鼠,因而其遺傳多樣性有限,這大大限制了利用正向遺傳學(xué)進(jìn)行小鼠突變位點(diǎn)的精細(xì)定位。因此,在本專題中我們將主要討論反向遺傳學(xué)技術(shù),特別是小鼠的基因剔除技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其應(yīng)用。通常情況下,當(dāng)我們對(duì)特定基因的細(xì)胞水平功能翻譯產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)組織表達(dá)譜進(jìn)行了系列分析后,會(huì)考慮應(yīng)用小鼠為模型對(duì)該基因的整體水平功能進(jìn)行研究。首先要做的事是對(duì)其在體功能的預(yù)測(cè)。例如,如果我們觀察到某一基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)被抑制或產(chǎn)生突變,而細(xì)胞學(xué)分析表明該基因的表達(dá)明顯抑制腫瘤生長(zhǎng),這時(shí)我們懷疑該基因可能是作為腫瘤抑制基因而發(fā)揮作用。通過(guò)表達(dá)譜分析,如果我們發(fā)現(xiàn)該基因只在特定組織和器官表現(xiàn)(如乳腺),可以猜測(cè)該基因可能只對(duì)乳腺癌可能有抑制作用。由于腫瘤生長(zhǎng)是異常表型,不生長(zhǎng)腫瘤為正常對(duì)照,我們推測(cè)該基因的基因剔除小鼠可能誘導(dǎo)乳腺癌的發(fā)生,而過(guò)表達(dá)該基因的轉(zhuǎn)基因小鼠可能并不會(huì)產(chǎn)生明顯表型。因此,針對(duì)這一基因,建立基因剔除小鼠可能更能反映基因功能。反之,如果我們觀察到特定基因在腫瘤細(xì)胞中過(guò)度表達(dá),而在腫瘤細(xì)胞中抑制該基因表達(dá)(通過(guò)RNAi技術(shù)等)抑制腫瘤細(xì)胞的生產(chǎn)和轉(zhuǎn)移。這時(shí)我們預(yù)測(cè)該基因?yàn)榘┗蚧蛟┗?。這時(shí)我們同樣要考慮組織特異性問(wèn)題,因?yàn)樵摶蚩赡苤挥绊懱囟ńM織細(xì)胞的癌變。在這種情況下,如果我們關(guān)心的是該基因在腫瘤發(fā)生中的功能,轉(zhuǎn)基因技術(shù)可能是更合適的選擇。如果不出所料,在相關(guān)組織中過(guò)表達(dá)該基因可能誘導(dǎo)腫瘤生成中的功能。如果我們一定要對(duì)原癌基因進(jìn)行基因剔除,我們可能觀察到什么現(xiàn)象或表型?許多原癌基因在維護(hù)正常組織功能,特別是正常的胚胎發(fā)育功能中起重要作用。如Notch、Wnt和TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵因子對(duì)腫瘤發(fā)展有重要影響,但它們的基因剔除小鼠常常表現(xiàn)出胚胎發(fā)育異常。在正常的胚胎發(fā)育過(guò)程中,這些因子的時(shí)空表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控,因此并不會(huì)直接誘發(fā)腫瘤。必須強(qiáng)調(diào)的是,轉(zhuǎn)基因小鼠或基因剔除小鼠并不一定出現(xiàn)預(yù)期的表型,整體動(dòng)物的研究遠(yuǎn)比分子水平或細(xì)胞水平的研究要復(fù)雜的多。例如,腫瘤抑制基因的基因剔除小鼠可能表型并不明顯,其原因也許在于體內(nèi)存在功能類似的同源基因代替了原基因的功能。這樣,有時(shí)必須將數(shù)個(gè)同源基因同時(shí)剔除才能看到預(yù)期的表型。另一種可能是該基因的功能只能在特殊環(huán)境下(如應(yīng)激和DNA損傷等)才能表現(xiàn)出來(lái)。因此必須將該小鼠置于這樣的環(huán)境條件下才能看到表型。當(dāng)然,最糟糕的情況是,我們只是做了錯(cuò)誤的預(yù)測(cè):因?yàn)榛虻恼w功能的確不是從分子和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果做簡(jiǎn)單推論就能預(yù)測(cè)的。當(dāng)預(yù)測(cè)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一樣時(shí),最主要的可能性是基因的多功能性能導(dǎo)致的胚胎期致死表型。例如,我們從體外實(shí)驗(yàn)中提示特定基因功能可能和學(xué)習(xí)記憶障礙相關(guān),可沒(méi)想到該基因同時(shí)影響胎盤的發(fā)育異常而導(dǎo)致基因剔除小鼠死于胚