核因子-b受體活化因子配體在人類(lèi)根尖肉芽腫和根尖囊腫組織中的表達(dá)

核因子-b受體活化因子配體在人類(lèi)根尖肉芽腫和根尖囊腫組織中的表達(dá)

慢性根尖炎是一種常見(jiàn)的上頜骨性疾病。主要病理類(lèi)型包括根尖肉芽腫和根尖囊腫。其重要病理學(xué)特征之一是炎癥性骨吸收,這與局部破骨細(xì)胞的形成和功能關(guān)系密切。近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的核因子-κB受體活化因子配體(receptoractivatorofnuclearfactorκBligand,RANKL)和骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)在介導(dǎo)破骨細(xì)胞分化和活化的過(guò)程中,分別是重要的正性和負(fù)性細(xì)胞外調(diào)節(jié)因子。RANKL和OPG在骨破壞性疾病中的研究已成為骨代謝研究的熱點(diǎn)。而這兩個(gè)新因子在慢性根尖周病損骨吸收機(jī)制中的作用研究較少。Sabeti等采用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法,對(duì)21個(gè)人類(lèi)根尖周病損組織中的RANKLmRNA進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果所有樣本中均有表達(dá)。張曉磊等在大鼠實(shí)驗(yàn)性根尖周病變過(guò)程中觀察到了RANKL表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。本研究采用免疫組織化學(xué)方法,檢測(cè)RANKL和OPG在根尖肉芽腫和根尖囊腫病損組織中的表達(dá)。旨在探討RANKL和OPG在慢性根尖周炎骨質(zhì)破壞中的作用。1數(shù)據(jù)和方法1.1研究對(duì)象的選擇在2004年6月至2007年6月北京大學(xué)口腔醫(yī)院病理科存檔的石蠟標(biāo)本中,選取病理診斷為根尖肉芽腫和根尖囊腫各20例,復(fù)習(xí)HE染色切片。臨床收集6例因正畸拔除的健康牙齒牙周膜組織作為正常對(duì)照組,制備石蠟標(biāo)本。所有研究對(duì)象(包括患者和健康人)均簽署了知情同意書(shū)。實(shí)驗(yàn)共分3組:根尖肉芽腫組(20例)、根尖囊腫組(20例)和健康牙周膜組(6例,正常對(duì)照組)。分別將石蠟標(biāo)本制作成4μm厚的連續(xù)切片,裱于經(jīng)APES處理的防脫玻片中。1.2免疫組化法1.2.1主試劑小鼠抗人RANKL和小鼠抗人OPG單克隆抗體均購(gòu)自R&D公司。兩步法Envison免疫組化試劑盒和抗體稀釋液均購(gòu)自DAKO公司。1.2.2rakenl和opg對(duì)人工林表達(dá)的影響將石蠟切片脫蠟至水。用枸櫞酸鹽緩沖液(0.01mol/L,pH6.0)在高溫、高壓下進(jìn)行抗原修復(fù),自然冷卻。用3%(體積分?jǐn)?shù))過(guò)氧化氫室溫孵育15min(用于封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性)。滴加一抗RANKL(稀釋度1∶100,4℃孵育過(guò)夜);一抗OPG(稀釋度1∶300,4℃孵育過(guò)夜)。滴加二抗,室溫孵育30min。用DAB顯色,蘇木精復(fù)染,脫水,透明,封片。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照,其余步驟同上。1.2.3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)陽(yáng)性染色呈棕黃色或褐色顆粒。鏡下,用盲法觀察,先在低倍鏡下觀察整張切片,然后在高倍鏡下每張切片選擇10個(gè)視野,計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞/視野,取各視野陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的平均值為陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)值。1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xˉ±s表示,用SPSS13.0軟件包處理數(shù)據(jù)。采用t檢驗(yàn)和one-wayANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2rakenl和opg在血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)RANKL陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞核內(nèi),少部分定位于細(xì)胞漿。RANKL多在浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞上表達(dá),成纖維細(xì)胞和漿細(xì)胞也有明顯表達(dá)。OPG陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞漿,少量在細(xì)胞核表達(dá)。OPG在淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、多形核白細(xì)胞、漿細(xì)胞和增生的上皮細(xì)胞上都有表達(dá),但RANKL和OPG在血管內(nèi)皮細(xì)胞少有表達(dá)。以PBS代替一抗的陰性對(duì)照染色為陰性(圖1,2)。與正常對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組根尖肉芽腫和根尖囊腫病損中的RANKL陽(yáng)性細(xì)胞均明顯增多,且RANKL/OPG的比率均明顯增加,上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但RANKL表達(dá)和RANKL/OPG比率在根尖肉芽腫和根尖囊腫兩組間的差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3組間OPG表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。3rakenl和opg對(duì)慢性根尖周炎組織的調(diào)節(jié)作用慢性根尖周炎多是由根管內(nèi)細(xì)菌感染引起的局部炎癥性疾病,常累及鄰近牙槽骨和根尖部的牙骨質(zhì),使其吸收破壞。骨吸收是破骨細(xì)胞(osteoclast,OC)在成骨細(xì)胞參與下,侵蝕骨質(zhì)的生物學(xué)行為。OC經(jīng)增殖、分化、生存與融合發(fā)育為多核的成熟OC,再經(jīng)活化成為功能性O(shè)C,其發(fā)揮骨吸收作用是一個(gè)復(fù)雜的多級(jí)調(diào)節(jié)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn),迄今至少有30余種局部因子參與調(diào)節(jié)骨代謝。近年來(lái)對(duì)慢性根尖周炎的骨吸收的研究主要集中在免疫防御反應(yīng)和細(xì)胞因子的作用兩方面。研究認(rèn)為白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1beta,IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(tumournecrosisfactoralpha,TNF-α)是人類(lèi)根尖周病變中重要的骨吸收促進(jìn)因子,可直接或間接參與骨吸收。Kawashima等的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,IL-2和IL-12等是主要的促骨吸收因子,而IL-4和IL-10等因子是主要的抑骨吸收因子。此外,學(xué)者們對(duì)前列腺素過(guò)氧化物合成酶(cyclooxygenase-2,COX2),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforminggrowthfactorbeta1,TGF-β1)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)等多種因子在慢性根尖周炎骨吸收中的作用進(jìn)行了研究。然而,這些因子僅對(duì)OC形成和活化有協(xié)同作用。目前認(rèn)為,OPG-RANKL和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophagecolony-stimulatingfactor,M-CSF)是OC發(fā)生的基本條件,局部RANKL表達(dá)的改變才是直接促使OC分化的關(guān)鍵。RANKL與位于OC前體細(xì)胞膜上的受體——核因子-κB受體激活子(receptoractivatorofnuclearfactor-κB,RANK)結(jié)合,刺激OC分化,增強(qiáng)成熟OC活性,發(fā)揮骨吸收功能。而OPG作為RANKL的誘餌受體(decoyreceptor),與RANKL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,阻斷RANKL和RANK間結(jié)合,抑制OC分化,抑制成熟OC的骨吸收活性并誘導(dǎo)其凋亡。在OC的形成、活化過(guò)程中,RANKL和OPG分別是重要的正性、負(fù)性細(xì)胞外調(diào)節(jié)因子,過(guò)量RANKL促進(jìn)骨吸收,過(guò)量OPG則抑制骨吸收。RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)是近10年來(lái)發(fā)現(xiàn)的影響OC分化、發(fā)育、功能調(diào)節(jié)的最重要信號(hào)通路,是全身因子和局部因子調(diào)節(jié)骨代謝的共同通路。幾乎所有的骨破壞疾病都是由于這一系統(tǒng)的平衡紊亂所致。本研究顯示,與健康牙周膜組織相比,慢性根尖周病損組織中的RANKL表達(dá)明顯增多,RANKL/OPG比率顯著上升,這與牙周炎和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等骨破壞性疾病的研究結(jié)果相一致。此外,3組中的OPG表達(dá)水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。慢性根尖周炎病損組織中的RANKL表達(dá)升高,而OPG表達(dá)無(wú)明顯變化,打破了正常組織中的微環(huán)境平衡,促進(jìn)OC分化,引起骨質(zhì)破壞。根尖周病損組中絕大多數(shù)樣本的RANKL表達(dá)明顯強(qiáng)于OPG表達(dá),僅有1例根尖肉芽腫和1例根尖囊腫中的OPG表達(dá)略高于RANKL,表明這2例病損組織中的骨吸收可能受到抑制。此外,正常對(duì)照組中RANKL的少量表達(dá)可能與正常根尖周牙槽骨組織的生理性骨代謝活動(dòng)有關(guān)。分組研究表明,根尖肉芽腫組的RANKL和OPG表達(dá)均略強(qiáng)于根尖囊腫組,但差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且RANKL/OPG的比率在兩組間的差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些與Menezes等2006年的研究結(jié)果基本一致。分析原因可能是根尖囊腫處于根尖病損發(fā)展的相對(duì)穩(wěn)定階段,其免疫反應(yīng)和骨代謝的活躍程度可能相應(yīng)降低。本研究觀察到在病損組織中有較多淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),RANKL多在淋巴細(xì)胞表達(dá)。但有所不同的是,Menezes等通過(guò)免疫組化檢測(cè),認(rèn)為RANKL主要在根尖周病損組織的巨噬細(xì)胞中表達(dá)。Metzger等認(rèn)為活化T細(xì)胞和活化巨噬細(xì)胞是參與根尖周炎骨吸收的主要細(xì)胞?；罨奘杉?xì)胞是誘導(dǎo)和產(chǎn)生骨吸收性細(xì)胞因子(如TNF-α和IL-1)的主要細(xì)胞。Arron等于2000年提出了“骨免疫學(xué)”(osteoimmunology)概念,正常免疫狀態(tài)下,OC的分化和活化主要依賴(lài)于成骨細(xì)胞,但在免疫系統(tǒng)被激活的狀態(tài)下,活化T細(xì)胞可表達(dá)RANKL,并通過(guò)相同途徑誘導(dǎo)OC成熟和活化,直接參與病理性骨吸收活動(dòng)。Kawai等推測(cè)T、